miR-338基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究

高志奎，刘　冉，尹立红，浦跃朴

miR-338基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究

高志奎，刘冉*，尹立红，浦跃朴

（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏南京210009）

目的： 探讨miR-338基因簇在食管癌组织中的表达模式及其与食管癌发病风险的关系。方法：选取86例经病理确诊的食管癌患者，分别提取食管癌和癌旁组织总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p与hsa-miR-657的表达，应用配对样本t检验分析癌和癌旁组织中miRNA表达差异，Pearson相关分析检验基因簇各miRNA表达的相关性，logistic回归分析miRNA异常表达对食管癌发病风险的影响。结果：hsa-miR-338-3p与hsa-miR-338-5p在食管癌组织中的表达均较癌旁组织降低(P均＜0.05)，hsa-miR-657在食管癌和癌旁组织中表达的差异无统计学意义(P＞0.05)，hsa-miR-338-3p与hsa-miR-338-5p表达显著相关(r=0.754，P＜0.05)，hsa-miR-338-5p的低表达增加了食管癌的发病风险(OR=1.264，P＜0.05)，可能是食管癌的危险因素。结论：miR-338 基因簇可能抑制了食管癌的发生，hsa-miR-338-5p可能成为食管癌诊断的潜在标志物。

miR-338；基因簇；食管癌；生物标志物

【ABSTRACT】OBJECTIVE: T o i nvestigate t he e xpression l evel o f m iR-338 c luster i n e sophageal c arcinoma a nd i dentifythe relationship between miR-338 cluster and esophageal carcinoma. METHODS：A total of 86 cases of patients withconfirmed esophageal carcinoma were selected，real time RT-PCR were performed to detect the expression of hsa-miR-338-3p，hsa-miR-338-5p and hsa-miR-657. We used paired t-test to analyze the expression of miRNA in tumor and adjacentnon-tumor tissues，Pearson correlation analysis to examine the correlation of the expression of each miRNA and logisticregression a nalysis t o a nalyze t he e ffect o f a bnormal e xpression o f m iRNAs o n t he r isk o f e sophageal c ancer. R ESULTS：hsamiR-338-3p and hsa-miR-338-5p were downregulated in tumor tissues compared with adjacent non-tumor tissues(P＜0.05)，and no statical difference was found of the expression of hsa-miR-657 between the two tissues (P＞0.05). Theexpression of hsa-miR-338-3p and hsa-miR-338-5p were significantly correlated (r=0.754，P＜0.05)，and low expressionof hsa-miR-338-5p was the risk factor for esophageal carcinoma (OR=1.264，P＜0.05). CONCLUSION：miR-338 clustermay play an important role in the formation process of esophageal carcinoma. In addition hsa-miR-338-5p may represent themiR-338 c luster t o b e a u seful b iomarker f or d iagnosis.

【KEY WORDS】miR-338；cluster；esophageal carcinoma；biomarker

microRNA(miRNA)是一类可参与内源性靶基因调节的非编码RNA，长度约为22～28个核苷酸[1]，已有大量研究证实其异常表达可能导致肿瘤的发生，影响其发展和预后[2-3]。miRNA在其启动子和操纵子的作用下进行表达，通常多个miRNA基因在染色体上聚集排列形成基因簇[4]。

由于位置的特殊性，一些成簇分布的miRNA受到共同的调控并以多顺反子的形式转录[5]。其编码产物在功能上可能会存在某种协同或者拮抗作用。有研究证实，一些miRNA基因簇在功能上比单个miRNA具有更高效的作用[6]。目前研究较多的miR-17-92、miR-143-145基因簇在多种动物、组织中影响肿瘤的发生发展，基因簇编码的各成熟miRNA发挥了一种协同作用[7-10]。

我们前期的食管癌miRNA芯片结果显示miR-338-3p在癌组织中表达下调[11]，miRbase数据库(http：//www.mirbase.org/)资料显示miR-338基因簇是一个在动物中高度保守的基因簇，hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-657编码基因共同参与组成miR-338基因簇。上述3个miRNA的编码基因均位于AATK基因内含子区，基因簇长度为673 bp，miR-338 基因簇可能在相同的启动子和调控子的作用下表达，在食管癌的发生发展中共同发挥重要作用。

有关miR-338基因簇的研究多局限于组成基因簇的单一成熟miRNA，本研究旨在通过检测miR-338基因簇编码的各miRNA在食管癌和癌旁组织中的表达，进而分析该基因簇的表达与食管癌发病的关系并初步探讨miR-338基因簇的表达模式。

1　材料与方法

1.1人体组织样本及一般资料

选取淮安市第一人民医院2009—2011年86例术后病理诊断食管癌患者。其中男性54例(62.8%)，女性32例(37.2%)，患者平均年龄(61.13±7.56)岁。收集外科手术切除的食管癌组织及对应癌旁组织标本，将组织剪至0.5 cm3大小，于-80 ℃保存备用。

1.2主要试剂和设备

Trizol试剂购自Invitrogen公司，SYBR Green Mix 购自Toyobo公司；MMLV购自Promega公司；dNTP 购自天根公司；核糖核酸酶抑制剂购自Thermo公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物购自锐博公司。

梯度基因扩增仪、低温高速离心机购自Eppendorf公司；Step one-Plus荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.3实验方法

使用Trizol提取组织总RNA，real time PCR测定成熟miRNA的表达，RiboBio Bulge-LoopTM引物进行逆转录及PCR。

呼伦忙给他赔不是，说老人不懂规矩，还望多多担当包涵，并保证这样的事情不会再一次发生。对方倒是客气，说没事没事，只需补栽几棵草也不麻烦。如果这草坪他自己说了能算，就让老人种上几棵豆角。谁家没有老人呢？只要能哄老人开心，草坪全部铲光了都没有关系。只是草坪是大家的，如果邻居们纷纷效仿，这草坪岂不成了菜园子？呼伦说那是那是。点头哈腰地将物业管理人员送走，转身刚想发作，见丈母娘正可怜巴巴地盯着自己，一副低头认罪听候处理的样子，也就不忍心再动干戈，忙摆摆手说没事没事，一头扎进书房，把自己包得像一只过冬的狗熊。

1.3.1逆转录取RNA模版0.5 µg，RT引物工作液1 µL，加无核酸酶水5.5 µ L，70 ˚ C 加 热10 m in，立即置于冰上2 min；随后加入5×RT Buffer 2.5 µL，2.5 mmol/L dNTPs 1 µL，200 U/µL MMLV 0.25 µL，40 U/µL 核糖核酸酶抑制剂0.25 µL，无酶水3 µL，置于PCR仪，42℃、1 h ，70 ℃ 、10 m in，逆转录产物用于定量PCR。

1.3.2实时荧光定量PCR反应体系：SYBR®Green PCR Master mix 4.5 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各0.4 µL，无酶水3.7 µL。反应程序：95 ℃预热5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s；40个循环，每个循环72 ℃收集荧光。熔解曲线：60～95 ℃每升温0.3 ℃ 收集荧光。

PCR产物的定量校正：选取U6为内参，同一样本miRNA与U6的CT值 相减，得到该样本miRNA的相对表达量∆CT值 。∆CT值 越大，表明实际表达量越低。

1.4统计分析

数据分析使用SAS 9.2完成，癌组织和癌旁组织中miRNA表达水平差异的分析采用配对样本t检验方法，各miRNA表达水平的相关性分析采用Pearson相关分析方法，miRNA异常表达与食管癌患病关系的分析采用logistic回归分析方法，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1miR-338基因簇成熟miRNA的表达

对癌组织和癌旁组织中成熟miRNA的相对表达量进行配对样本t检验(见表1)，与癌旁组织相比，食管癌组织中hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p显著低表达，其表达量(2-∆∆CT)分别是癌旁组织的0.621和0.506，hsa-miR-657在两种组织中的表达差异则无统计学意义。

表1　食管癌中miR-338基因簇的相对表达

对hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p和hsa-miR-657的相对表达量∆CT进 行Pearson相关分析(见图1)，结果显示3组miRNA相互之间表达的相关性均具有统计学意义(P＜0.05)。hsa-miR-338-3p与hsa-miR-338-5p表达高度相关 (r=0.754，P＜0.05)；hsa-miR-657与hsamiR-338-3p的相关系数为0.653，与hsa-mi-338-5p的相关系数为0.500。

图1　miRNA表达的相关性分析

2.3miRNA表达与食管癌患病风险

为了评估miRNA异常表达与食管癌患病之间的关系，对数据进行1∶1配对条件logistic回归分析(见表2)。结果显示hsa-miR-657的表达未引起食管癌发病风险的改变，hsa-miR-338-5p、hsa-miR-338-3p表达的降低会增加食管癌的发病风险。

表2　miRNA异常表达与食管癌患病风险的条件logistic回归分析

对hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p进行多因素logistic回归分析(见表3)，最终hsa-miR-338-5p进入方程，hsa-miR-338-5p低表达会引起食管癌发病风险升高(OR=1.264，P＜0.05)。

表3　miR-338基因簇与食管癌发病风险的条件logistic回归分析

3　讨论

有研究表明miR-338-3p在多种癌组织和细胞中下调表达并发挥重要作用。在结直肠癌细胞中，miR-338-3p可以抑制Smoothened蛋白表达，进而抑制细胞的侵袭和迁移能力[12]。在胃癌细胞中，miR-338-3p可直接作用于ZEB2和MACC1，抑制上皮间质化过程[13]。Li等[14]研究发现miR-338-3p可以抑制食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成，在裸鼠中过表达miR-338-3p，种植肿瘤的生长受到抑制，本研究显示miR-338-3p在人食管癌中显著低表达(t=2.983，P＜0.05)，miR-338-3p可能在人食管癌的形成中发挥了抑制作用。

有研究发现miR-338-5p在结直肠癌组织和血浆中异常表达，肝癌患者血浆中miR-338-5p与AFP表达负相关，miR-338-5p可能成为结直肠癌和肝癌的早期诊断标志物[15-16]。对移植肾脏组织研究发现，miR-338-5p表达与移植患者的生存显著相关，miR-338-5p可以作用于TRAF3，引起BAFF信号的改变，从而引起移植肾脏后免疫反应的改变[17]。与多种癌组织中低表达趋势相一致，本研究发现miR-338-5p在人食管癌中显著低表达(t=4.309，P＜0.05)，其可能成为食管癌的诊断标志物。

Yan等[18]研究发现早期喉癌中miR-657异常表达，统计分析表明miR-657可以较好的区分早期喉癌和正常黏膜组织，其可能成为早期喉癌的诊断标志物。miR-657可以结合IGF2R的3'UTR区并参与调节Hep-G2细胞中IGF2R的表达，Lv等[19]分析认为其与2型糖尿病AACA序列的插入和缺失相关。Zhang等[20]研究发现肝癌组织中miR-657高表达，在免疫缺陷小鼠中过表达miR-657可见肝癌细胞的增殖以及克隆形成能力增强，实验证实miR-657可以作用于TLE1，通过NF-kappa B信号通路促进肝癌的形成。本研究并未发现食管癌和癌旁组织中miR-657的表达存在显著差异，推测可能是miR-657的组织、时间特异性表达所致。

我们应用Pearson相关对miR-338基因簇各miRNA的表达进行分析，结果显示，hsa-miR-338-3p、hsamiR-338-5p、hsa-miR-657在表达上高度相关(P＜0.05)，来自于同一前体的hsa-miR-338-3p与hsa-miR-338-5p相关系数高达0.754，位置上紧密排列的miR-338基因簇表达miRNA的过程可能受到某些共同的调控。多因素logistic分析显示hsa-miR-338-5p的低表达是食管癌的危险因素(OR=1.264，P＜0.05)，hsa-miR-338-3p并未进入最终方程，考虑是由于两者之间表达高度相关所致。

综上，miR-338基因簇可能作为一个整体，参与了复杂的分子信号调控网络，共同影响了食管癌的发生发展，hsa-miR-338-5p可能在该通路的调控中发挥了主要作用，其可能代表miR-338基因簇成为食管癌诊断的标志物。miR-338基因簇调控食管癌的分子机制有待于进一步实验的研究。

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A case-control study on the risk of esophageal carcinoma and miR-338 cluster

GAO Zhikui，LIU Ran*，YIN Lihong，PU Yuepu
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R730.2

A

1004-616X(2016)02-0107-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.005

2015-11-17；

2016-01-04

国家自然科学基金(81172747，81573108，81573191)

作者信息： 高志奎，E-mail：gaozhikuijy@163.com。*

，刘冉，E-mail：ranliu@seu.edu.cn