双醛低聚异麦芽糖交联脱细胞猪真皮基质的研究

陈一宁，但年华,2，王　磊，何　灿，但卫华,2

(1. 四川大学 皮革化学与工程教育部重点实验室， 成都 610065；2. 四川大学 生物医学工程技术研究中心， 成都 610065)



双醛低聚异麦芽糖交联脱细胞猪真皮基质的研究

陈一宁1，但年华1,2，王磊1，何灿1，但卫华1,2

(1. 四川大学 皮革化学与工程教育部重点实验室， 成都 610065；2. 四川大学 生物医学工程技术研究中心， 成都 610065)

采用新型交联剂氧化低聚异麦芽糖(IMODA)交联脱细胞猪真皮基质(pADM)，优化最佳交联条件，考察了交联材料(IMODA-pADM)的收缩温度、改性指数、傅里叶红外光谱、机械性能、亲水性、吸湿性、表面形貌、耐酶解性能及细胞相容性。结果显示，交联材料的收缩温度随IMODA的用量、反应温度、反应时间的增加而先增大后趋于稳定，随pH值的增加而先增大后减小。交联最优条件为，反应温度37 ℃、用量16%、反应时间18h、pH值为9.4；随用量增大，交联材料改性指数增大，物理机械性能提高，亲水性与吸湿性略有降低，耐酶解性能大幅提高；交联后材料更为紧实，材料表面有利于细胞粘附生长，细胞形态良好，细胞毒性为0-Ⅰ级。

交联；双醛低聚异麦芽糖；脱细胞猪真皮基质

0　引　言

胶原是最重要的细胞外基质之一，为水不溶性纤维蛋白，是动物体内含量最多的蛋白质，广泛存在于皮肤、韧带、肌腱、软骨等结缔组织或器官中，具有其它高分子材料不可比拟的生物学性质及生物降解性[1-2]。脱细胞猪真皮基质(pADM)除去了猪真皮中的细胞成分，只保留了胶原纤维支架，是良好的生物医用材料，但变性温度低、机械强度低及耐蛋白酶降解能力差等特点在一定程度上限制了其应用，需要通过交联改性来改善pADM的物理机械性能、稳定性、降低抗原性，调节适宜的降解性。常用改性胶原的化学改性剂包括：醛类、环氧化合物、碳化二亚胺、己二异氰酸酯、纳米材料等[3]，但化学改性剂往往会对材料的生物学性能造成一定不良影响。天然糖类广泛存在与自然界中，具有安全无毒、能够在体内降解代谢、具有较高的生物活性等特性。双醛多糖是近年来胶原改性剂的研究热点之一，由于醛基具有较高的反应活性，使双醛多糖具有交联胶原的可能性[4]。目前双醛海藻酸钠等双醛多糖已应用于胶原类材料的改性，效果良好，且生物相容性俱佳[5]。但双醛多糖分子量大，对于致密的胶原组织存在渗透性差、内部交联困难的缺点。低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide，IMO)又称分枝低聚糖，是指一类由2～10葡萄糖以α-1，6糖苷键结合而成的低聚糖[6]，与多糖相比，既保留了分子的主要结构单元，同时分子量小，水溶性好，渗透快。将IMO选择性氧化后制备的氧化低聚异麦芽糖(IMODA)作为新型交联剂，用于具有致密结构的pADM的交联，有望继承氧化多糖交联的优点，克服其缺点。交联后的胶原pADM，成为糖基化修饰胶原，兼具两者的优点，且分子之间为共价键结合，结构稳定均一，具有共混不可拟的优越性。本文以脱细胞猪真皮基质中的胶原纤维为胶原模板，以IMODA为交联剂，研究两者之间的交联作用及产物的性能。

1　实验材料和仪器

脱细胞猪真皮基质[7]，自制；氧化低聚异麦芽糖(氧化度69%)，自制；数字式皮革收缩温度测定仪，MSW-YD4，陕西科技大学阳光电子研究所；冷冻干燥机，Freeze6，美国Labconco；傅里叶红外光谱仪，MAGNAIR560，美国Nicole；电子拉力机，GT-AI-7000S，台湾高铁科技股份有限公司；二氧化碳培养箱，3111，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；酶标仪，BIO-RAD680，美国伯乐公司；细菌Ⅰ型胶原酶，生化级，Sigma-Aldrich公司；改良型RPMI-1640培养基，赛默飞世尔生物化学制品有限公司；胎牛血清，上海复蒙基因生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

2　实验内容及方法

2.1交联反应及条件优化

将一定质量的IMODA溶解于盛有缓冲溶液的锥形瓶中，加入pADM，使其完全浸没于溶液中，置于可控温的摇架中反应。采用单因素法分别对IMODA用量、反应温度、反应时间、反应体系pH值进行优化。反应结束后用蒸馏水反复清洗以除去未反应完的IMODA，冷冻干燥，备用。

2.1.1反应时间

控制反应温度为37 ℃，IMODA用量为pADM干重的8%(质量分数)，pH值8.4，反应时间分别为6，12，18和24h。

2.1.2反应温度

控制IMODA用量为pADM干重的8%(质量分数)，pH值8.4，分别在27，32，37和42 ℃的温度条件下反应18h。

2.1.3IMODA用量

在37 ℃、pH值8.4下，选取IMODA的用量分别为pADM干重的4%，8%，12%，16%和20%，反应18h。

2.1.4反应体系pH值

在37 ℃下，加入pADM干重16%的IMODA，在pH值分别为7.4、8.4、9.4、10.4的缓冲溶液中反应18h。

2.2交联材料的性能表征

2.2.1收缩温度

将IMODA交联pADM得到的材料(IMODA-pADM)制成5mm×70mm，测定其收缩温度，每个试样测3个平行样。

2.2.2自由氨基与改性指数

通过茚三酮比色法，测得交联材料的自由氨基量[8]，按式(1)计算得到改性指数。

(1)

2.2.3傅里叶红外光谱(FT-IR)

将不同交联剂用量得到的IMODA-pADM刮取少量纤维，与适量KBr研磨，压制成片，在傅里叶红外光谱仪上测定，设置扫描波数450～4 000cm-1，分辨率4cm-1，扫描次数32次。

2.2.4物理机械性能

将不同交联剂用量的交联材料制成哑铃状，空气调节48h后，在拉力机上以100mm/min速度测定抗张强度与断裂伸长率，每个式样测定3个平行样[9]。

2.2.5吸湿率、吸附水率与溶胀率

测定并计算不同交联剂用量得到的IMODA-pADM的吸湿率、吸附水率与溶胀率[10]

2.2.6亲水性

将不同交联剂用量得到的IMODA-pADM制成15mm×70mm大小，采取坐滴法，以6μL新煮沸并冷却的蒸馏水液滴滴于材料表面上，测得接触角，每个式样测定5个平行样。

2.2.7SEM

通过扫描电子显微镜(SEM)对交联前后材料表面进行形态学观察。

2.2.8耐酶降解性能分析

采用细菌Ⅰ型胶原酶对交联材料的耐酶降解性能进行了考察。取一定质量(记为W1)交联材料放入含有细菌Ⅰ型胶原酶的培养液(1U/mL，3mL/mgpADM样品)中在37 ℃下孵化7d。分别在第1，2，4和7d取出样品，用蒸馏水清洗3次后，冷冻干燥，称重(记为W2)。样品的降解率由式(2)计算得出

(2)

2.2.9细胞毒性测定

采用L929成纤维细胞，测定最佳交联条件下制备的IMODA-pADM的浸提液细胞毒性及接触细胞毒性[11]。

3　结果与讨论

3.1交联反应条件优化

脱细胞猪真皮基质材料的主要成分是胶原(纤维)，具有许多可参与交联反应的活性基团，如氨基、羧基、巯基等。IMODA中富含醛基，链长适宜，故它能够与pADM产生单点或多点结合，在胶原纤维内部与胶原纤维间形成稳定交联，从而提高材料的湿热稳定性能，在宏观上表现为交联材料收缩温度的提高。

3.1.1反应时间对交联材料收缩温度的影响

如图1所示，随着反应时间的延长，IMODA-pADM收缩温度(Ts)先增大后略有降低，18h时收缩温度最高。当反应时间小于18h时，随着反应时间的延长，胶原上更多的活性基团逐步与IMODA发生反应，18h后，一方面，可参与反应的活性基团反应趋于完全，反应逐渐减缓；另一方面，胶原在反应介质中的长时间浸渍可能会导致胶原纤维间的部分连接松弛甚至断裂，综合而言反而使得收缩温度略有下降。故反应温度以18h为宜。

图1　反应时间对交联材料收缩温度的影响

Fig1TheeffectofhourstotheTsofIMODA-pADM

3.1.2反应温度对交联材料收缩温度的影响

在化学反应中，升高温度能使反应体系能量增加，有利于加速分子热运动，分子间的有效碰撞增多，更多的分子突破反应的活化能而发生反应，有利于反应速度的加快。此外，醛基与氨基的反应为吸热反应，升高温度有利于化学平衡向生产产物的反向转变。由图2可见，随着反应温度的升高，IMODA-pADM的收缩温度先升高后降低。当反应温度较低时(<37 ℃)，提高温度，有利于更多的IMODA分子和胶原上的活性基团克服能垒而发生结合，故在相同时间内交联程度得以提高。再继续升高温度(>37 ℃)，材料的收缩温度无明显提高。可能是反应进行的同时，pADM中胶原纤维部分连接松弛甚至断裂，会导致收缩温度略有降低。故最适反应温度为37 ℃。

图2　反应温度对交联材料收缩温度的影响

Fig2Theeffectoftemperaturetotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.1.3IMODA用量对交联材料收缩温度的影响

发生化学反应时，反应物用量的增加有利于反应向右进行。胶原上的活性基团是一定的，可以通过增加IMODA用量，来控制其交联程度。IMODA用量增加，其与胶原间形成的单点结合与多点交联都有所增加，从而使交联程度增加，材料的耐湿热稳定性提高。由图3可知，随着IMODA用量增大，IMODA-pADM的收缩温度与先增大后略有降低。当IMODA用量较小时(<16%)，参与交联反应的胶原中的活性基团较少，交联程度较低，收缩温度较低；用量增大后，胶原分子中更多的活性基团与IMODA中的醛基作用，交联反应发生的可能性增大，交联程度提高，收缩温度增大；当用量过大时，IMODA分子中的醛基间会产生竞争，收缩温度略有降低。

图3　用量对交联材料收缩温度的影响

Fig3Theeffectofdosagetotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.1.4反应体系pH值对交联材料收缩温度的影响

图4　pH值对交联材料收缩温度的影响

Fig4TheeffectofpHtotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.2交联材料的性能表征

3.2.1用量对交联材料改性指数的影响

已有研究表明，在碱性条件下，胶原侧链赖氨酸中的ε-氨基是胶原侧链氨基酸残基中最具反应活性的基团[11]。胶原的链端及侧链上含有大量活性氨基(自由氨基)，IMODA中的醛基可与其反应形成席夫碱交联结构，故可由自由氨基的变化(改性指数)来表征IMODA与pADM的改性程度。由图5可见，随着IMODA用量的逐渐增加，IMODA-pADM的改性指数逐渐增大后略有降低。当用量较小时，有限的IMODA与pADM中的氨基发生交联反应，消耗的氨基数量较少，故而改性指数较低；增大交联剂用量，大量醛基与氨基发生反应，氨基数量进一步降低，改性指数逐步增大；当用量为16%时，改性指数最大。此外，对于生物材料而言，自由氨基数量的降低有利于降低材料的抗原性。

图5　用量对交联材料改性指数的影响

Fig5Theeffectofdosagetothemodificationindexofcrosslinkedmaterials

3.2.2不同用量交联材料的红外光谱(FT-IR)

图6不同用量IMODA交联的IMODA-pADM红外图谱

Fig6FT-IRspectraofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.3用量对交联材料的物理机械性能的影响

如表1所示，随着IMODA用量的增加，IMODA-pADM的抗张强度逐渐增大，断裂伸长率逐渐降低。表明交联反应使IMODA-pADM的力学强度得到了提高，这与耐湿热稳定性的提高是一致的。良好的力学强度能够保证IMODA-pADM在作为生物材料的使用过程中具有避免由于挤压、拉伸等原因而产生变形的能力。IMODA-pADM的断裂伸长率的降低可能是交联发生在胶原纤维分子内、分子间及微纤维间，促使胶原纤维内形成了较为稳定的“刚性结构”，纤维发生了某些定向的聚集，在拉伸的过程中，不容易发生形变，较易引起应力集中，导致“脆断”的发生，从而降低了相应的断裂伸长率[12]。

表1不同用量交联的IMODA-pADM抗张强度及断裂伸长率

Table1TensilestrengthandlongationatbreakofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

IMODA用量/%抗张强度/MPa断裂伸长率/%01.31±0.1220.46±1.1242.27±0.0914.88±0.8582.37±0.2011.31±1.19122.89±0.098.83±0.95163.23±0.176.40±2.10203.05±0.215.45±1.34

3.2.4用量对交联材料吸湿性、吸附水率与溶胀率的影响

由图7可知，随着IMODA的用量增加，IMODA-pADM吸湿性、吸附水率与溶胀率均有下降。这可能是由于IMODA与pADM发生交联反应封闭了亲水基团氨基，随着IMODA用量的增加，交联反应的程度加深，未封闭的亲水基团数量减少，于是导致了吸湿性和吸附水率的下降。同时随着交联反应的程度加深，pADM纤维被拉紧，间隙变窄，自由水含量减少，溶胀率下降。

图7不同用量交联的IMODA-pADM的吸湿性、吸附水率与溶胀率

Fig7Moisturerate,swellingrateandcapillarywaterabsorptionrateofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.5用量对交联材料亲水性的影响

由图8可以看出，随着IMODA的用量增加，IMODA-pADM的接触角有所增加，亲水性略有降低，变化并不明显。这与交联材料的吸湿性、吸附水率与溶胀率的变化是一致的。

图8　不同用量交联的IMODA-pADM接触角

Fig8ContantangleofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.6交联前后材料表面形貌观察

pADM是由胶原纤维无规编织而成，纤维之间存在大量不规则的间隙。图9显示，在最优条件下交联后得到的交联材料(16%-IMODA-pADM)胶原纤维的天然基本结构不变，胶原纤维纵横交错，同时保持着较高的孔隙率，孔径大约在30～100μm间。一般来说，材料孔径在20～120μm时，对成纤维细胞的生长十分有利，说明制备的IMODA-pADM适宜于用作细胞生长支架。当交联剂用量较大时(如16%)，纤维间隙略感变窄。

图9　交联前后pADM表面SEM图片

Fig9SEMphotographsofpADMbeforeandaftercrosslinking

3.2.7耐酶降解性能分析

由图10可以看出，用量为4%，8%，12%，16%和20%的氧化低聚异麦芽糖改性pADM在Ⅰ型胶原酶中均呈现出很强的抵抗降解的能力，经过1d的降解未交联组降解了约45%，而交联组降解均小于6%，且氧化低聚异麦芽糖用量越大，其降解率越低。

图10不同用量氧化低聚异麦芽糖改性pADM在Ⅰ型胶原酶中的降解曲线

Fig10ResistancetodegradationofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

经过2d的作用后，未交联组接近完全降解。经过7d的作用后，4%-IMODA-pADM降解率为16.5%±1%，8%-IMODA-pADM降解率为10.1%±1.4%，12%-IMODA-pADM降解率为8.4%±0.5%，16%-IMODA-pADM降解率为7.0%±0.2%，而20%-IMODA-pADM降解率仅为6%±0.7%，说明使用IMODA交联pADM可大幅提高材料的耐酶降解性能，这与IMODA-pADM的耐湿热稳定性是一致的。材料抗酶解能力的提高一方面得益于IMODA与pADM可形成分子内交联、分子间交联及微纤维间的交联，即在材料内形成体型结构交联使材料的结构稳定性大幅增强。另一方面是由于交联后胶原结构稍有紧实，具有更低的表面积。因为酶主要影响基质表面，相对于非交联的胶原，单位时间内胶原酶将降解更少的交联过的胶原。

3.2.8交联材料细胞毒性

表2显示，最优条件下交联得到的16%-IMODA-pADM浸提液细胞毒性为0-Ⅰ级，生物相容性良好，符合体表使用要求。图11为细胞在IMODA-pADM材料上生长的SEM图片，可以看出细胞生长状态良好，形态饱满为梭形，牢牢地粘附于IMODA-pADM的纤维上生长，证明了IMODA作为胶原改性剂生物相容性能优良。IMODA是由天然产物低聚麦芽糖经选择性氧化而得，只有部分糖基被氧化，保留了糖分子的大部分结构，因而保留了良好的生物相容性。将其作为胶原交联剂，克服了合成交联剂本身生物毒性大以及可能导致试剂残留的缺陷，不会对胶原的生物相容性造成不良影响，因而几乎无细胞毒性。

表2　IMODA-pADM浸提液细胞毒性实验结果

图11L929成纤维细胞在16%-IMODA-pADM上生长3d后扫描电镜图(×1 000，×2 000)

Fig11SEMphotographsofL929fibroblastculturedfor3don16%-IMODA-pADM(×1 000,×2 000)

4　结　论

胶原具有优异的生物相容性，但也存在耐降解能力差等缺陷。合成交联剂虽然具有结构可控性强的优点，但也存在制备副产物难以纯化以及试剂残留的不足。从植物中提取的交联剂(如京尼平)，往往价格昂贵，难以产业化应用。天然多糖广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，也是构成生命的四大基本物质之一，具有优良的可降解性、生物相容性等优点，但分子量大，水溶性不佳，反应能力不足。氧化寡糖保留了多糖的主要链单元结构，保留其多糖的主要功能性(可降解性、生物相容性)，同时分子量更小、水溶性更佳；通过选择性部分氧化得到的醛基，同时赋予其优良的化学活性(交联性)，特别适用于交联具有紧密结构的生物材料(如含氨基的多糖、胶原等)，能够深入渗透到生物材料结构中，并产生稳固的交联结构，得到的交联材料，交联程度高、生物相容性好。本文以价格低廉的低聚异麦芽糖经氧化后得到的双醛低聚异麦芽糖为原料，对pADM(胶原)进行交联改性，证明氧化寡糖作为新型生物交联剂，具有优良的性能，有望广泛应用于生物材料领域。

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Studyonprocineacellulardermalmatrixcrosslinkedbyisomaltooligosaccharidedialdehyde

CHENYining1,DANNianhua1,2,WANGLei1,HECan1,DANWeihua1,2

(1.KeyLaboratoryofLeatherandEngineeringofMinistryofEducation,SichuanUniversity,Chengdu610065,China;2.NationalEngineeringLaboratoryforCleanTechnologyofLeatherManufacture,SichuanUniversity,Chengdu610065,China)

Porcineacellulardermalmatrix(pADM)wascrosslinkedbyanewtypecrosslinkerwhichiscalledisomaltooligosaccharidedialdehyde(IMODA),thecrosslinkingconditionswereoptimized.themodificationindex,fouriertransforminfraredspectroscopy,mechanicalproperties,hydrophilicity,scanningelectronmicroscopyandthecytotoxicityofIMODA-pADMweretested.Theresultsindicatedthatwhenthedosage,reactiontemperatureandreactiontimewereincreased,theshrinkagetemperaturewasincreasedfirstlyandthengraduallystayedsteady,whenthepHvaluewasincreased,theshrinkagetemperaturewasincreasedfirstlyandthendecreased.Itwasshowedthatthecomprehensiveperformancewasbestwhenthereactiontemperaturewas37 ℃,thereactiontimewas48h,dosagewas16%,pHvaluewas9.4.Aftercrosslinking,thetensilestrengthofIMODA-pADMwasimproved,thehydrophilicitywasweakened,thesurfaceofthematerialisconducivetotheadhesionandgrowthofcells,andthectotoxicitygradeofcrosslinkedmaterialwasgrade0-Ⅰ.

crosslink;isomaltooligosaccharidedialdehyde;porcineacellulardermalmatrix

1001-9731(2016)05-05195-06

国家自然科学基金资助项目(51473001)；大学生创新创业计划资助项目(201510610972)

2015-10-10

2015-11-26 通讯作者：但年华，E-mail:lamehorse-8@163.com

陈一宁(1991-)，女，成都人，在读硕士，师承但卫华教授，从事胶原基生物医用材料研究。

R318.08

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.05.037