超声波辅助提取乌纠中总黄酮的工艺研究*

姜艳萍，李春荣， 孟铁宏

(黔南民族医学高等专科学校公共课教学部化学教研室，贵州　都匀　558000)



超声波辅助提取乌纠中总黄酮的工艺研究*

姜艳萍，李春荣， 孟铁宏

(黔南民族医学高等专科学校公共课教学部化学教研室，贵州都匀558000)

为科学合理利用苗药乌纠，利用超声波辅助提取技术提取乌纠中的总黄酮，并采用紫外可见分光光度法测定了苗药乌纠中总黄酮的含量，芦丁标准曲线为A=0.0133C+0.0042，标准曲线相关系数R=0.9983。在检测波长510 nm下，测得总黄酮含量为11.56 mg/g，平均回收率为99.7%，相对标准偏差(RSD)为0.60%(n=5)，实验结果为今后苗药乌纠的科学利用和质量控制研究提供了依据。

乌纠；黄酮；紫外分光光度法

苗药乌纠是铁角蕨科、铁角蕨属类植物变异铁角蕨(Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.) 的全草，又名九倒生、铁郎鸡、地柏枝，主要分布在云南、贵州、四川和山西等地[1]。乌纠作为贵州苗族居住地区传统的民间药用植物，具有止血生肌，主治骨折，刀伤，疮疡溃烂，烧烫伤[2]。

迄今为止，铁角蕨类植物化学成分的研究仅有过山蕨化学成分的研究报道[3]，对变异铁角蕨乌纠的化学成分[4]，特别是黄酮类成分的研究还未见报道。本文采用紫外可见分光光度法测定了苗药乌纠提取物中总黄酮的含量[5]，重复性好，简便，易操作，为合理开发利用苗药乌纠提供评价依据。

1　实验准备

1.1药材与试剂

乌纠：产地贵州苗族地区，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨(Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev. )的全草。

芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所)，95%乙醇，NaNO2，A1(NO3)3，NaOH以上药品均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2仪器

Sarteorius-BS110S电子分析天平；SG-4050C电热恒温水浴锅，天津市泰斯特有限公司；KQ-250B型超声波清洗器；MU5100DUVFR实验室超纯水系统；cary100紫外可见分光光度计。

2　方法与结果

2.1标准曲线的绘制

准确称在120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg置于50 mL 容量瓶中，加60%乙醇超声溶解，定容，摇匀，配制成浓度为100 μg/mL芦丁标准品溶液[4]，作为贮备液备用。

精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准品溶液于10 mL容量瓶，依次分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL摇匀，放置6 min，然后再加10% A1(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，最后加1% NaOH溶液4 mL，用60%乙醇定容，显色，静置15 min后，用紫外可见分光光度计测510 nm处的吸光度[6-8]。试剂空白为参比，芦丁标准品的浓度为横坐标，510 nm处的吸光度为纵坐标作图，得到芦丁标准曲线见图1。

图1　芦丁标准品吸光度-浓度标准曲线Fig.1　Standard rutin curve of absorbance-concentration

2.2重现性试验

按照绘制标准曲线的方法，精密量取1.5 mL芦丁标准溶液5份，按2.1标准曲线绘制操作方法进行测定吸光度。测定结果见表1，从表1测定结果可以看出，实验的标准偏差和相对标准偏差都较小，说明实验测定方法可取，实验测定数据重现性良好[9]。

表1　芦丁标准品重现性实验结果Table 1　Result of repetition experiment of standard rutin

2.3样品的测定

2.3.1样品溶液的制备

准确称取1.0000 g干燥的乌纠固体粉末，置于100 mL锥形瓶中，按料液比1:60加入60%乙醇溶液60 mL，放人超声波提取器中，在3500 W 功率下进行超声提取40 min，然后将提取样品置于60 ℃进行水浴30 min，实验完毕后，冷却至室温，过滤，滤液定容于100 mL容量瓶中，摇匀，得到乌纠提取样品溶液[10-11]。

2.3.2样品中总黄酮含量的测定

准确量取样品溶液2 mL于10 mL的容量瓶，依次加入5%的亚硝酸钠、10%的硝酸铝、1%的氢氧化钠，用60%的乙醇定容。显色后，利用紫外可见分光光度计按照标准曲线下设定的条件进行测定吸光度，样品做5次平行测定。结合标准曲线拟合公式计算总黄酮含量，计算公式如下：

实验测得苗药乌纠中总黄酮含量为11.56 mg/g，相对标准偏差为0.60%。

表2　样品中总黄酮含量测定结果Table 2　Result of determination of flavonoids of sample

2.3.3精密度试验

准确量取样品溶液1 mL于10 mL的容量瓶，按照标准曲线法进行操作，重复测定5次。实验结果见表3，由表3可知，计算总黄酮含量测定结果的平均值为0.0815，相对标准偏差RSD为0.11%，说明实验测定数据的精密度高，实验的测定结果重现性较好。

表3　总黄酮精密度实验结果Table 3　Result of precision experiment of flavonoids

2.3.4显色时间的稳定性试验

分别取芦丁标准溶液和样品测试液2.5 mL于10 mL的容量瓶，按照标准曲线法显色后，每隔10 min测定一次，限定时间为2 h[12]。实验结果表明，室温下，当芦丁标准溶液和样品溶液均显色后，在设定的时间范围内，其吸光度随时间的增加而变化并不大，说明在2 h内芦丁标准品溶液和样品溶液均是稳定的，为后续实验结果的准确测定提供了保障。

2.3.5加标回收试验[13]

根据加标回收试验要求，向已知总黄酮含量的5份乌纠黄酮提取样品溶液中分别加入5 mg的芦丁标准品，按照样品测定方法进行测定加入芦丁标准样品后的提取样品溶液，由测定试验结果，计算加标回收率。由表4实验数据可知，加标回收率在99.2%～101.0%之间，平均回收率为99.7%，相对标准偏差RSD为0.81%，实验结果符合回收率要求，说明用该方法测定总黄酮含量准确度良好，实验方法可行。

表4　加样回收率实验结果Table 4　Results of addition recovery experiment

3　结　论

乌纠作为贵州苗族民间传统药用植物，含有大量的黄酮类成分，黄酮类物质具有降脂、降糖、降低血压以及改善人体血液循环等多种生理活性[14]，在抑制癌症，抗击衰老等方面也发挥着重要作用，在医药领域具有极广的应用前景。目前，乌纠作为贵州苗族地区传统中药材，其使用仅限于民间用药，主要用于治疗骨折、刀伤及皮肤烫伤等。

本文利用超声波辅助提取技术提取，并通过紫外可见分光光度法测定了乌纠中总黄酮的含量为11.56 mg/g，相对标准偏差RSD为0.60%，实验结果准确度高，偏差较小，以期为大力开发和科学利用乌纠价值提供实验依据，也为今后测定铁角蕨属类植物中总黄酮的含量提供了一种简便、易行的方法。

[1]胡成刚,赵能武,王培善,等.黔产铁角蕨科药用植物的种类和分布研究[J].安徽农业科学,2008,36(22):9607-9608.

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[3]李宁,李铣,冯志国,等.过山蕨中有机类化学成分研究[J].中草药,2007,38(7):970-972.

[4]王玲,何兆荣.药用蕨类植物化学成分研究进展[J].中国野生植物资源,2006,3(10):25-26.

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[6]陈文,王湘君,赵阳.海南五指山苦丁茶黄酮含量研究[J].琼州学院学报,2011,18(5):14-16.

[7]姚志凌,李明辉.橘红化瘀散中黄酮含量测定[J].光明中医,2012,27(6):1108-1110.

[8]陈烨,陈圆圆.不同产地菊花的黄酮含量及纯化[J].按摩与康复医学,2014,5(3):147-149.

[9]郑媛媛,李辰,封士兰,等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析,2011,31(2):547-550.

[10]薛梅,王自军,颜豫君,等.金樱子中总黄酮和多糖的微波提取与含量测定[J].食品工业科技,2005,26(10):133-135.

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[12]吴鸿伟.石榴籽提取物中总黄酮含量测定[J].衡水学院学报,2009,11(4):54-56.

[13]李春荣,孟铁宏.枇杷花茶中微量元素的溶出特性研究[J].山东大学学报(理学版),2014,49(7):7-11.

[14]韩公羽,沈企华.植物药有效成分的研究与开发[M].杭州:杭州大学出版社,1991:94-102.

Determination of Flavonoids from Miao Medicine Asplenium varians Wall. ex Hook.et Grev. with Ultraviolet Spectrophotometry*

JIANGYan-ping,LIChun-rong,MENGTie-hong

(Qiannan Medical College for Nationalities, Guizhou Duyun 558000, China)

In order to scientific and reasonable use Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev., ultrasonic-assisted was used to extract flavonoids in Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev. The concentration of flavonoids in Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev. was determined with ultraviolet spectrophotometry. The egression equation of rutin standard curve was A=0.0133C+0.0042, R=0.9983, the relative standard deviation was 0.60% and the average recovery was 99.7%, the detection of total flavonoids was at 510 nm wavelength and its level was 11.56 mg/g(n=5), the results provided scientific basis for the utilization of Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.

Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.; flavonoids; ultraviolet spectrophotometry

黔南民族医学高等专科学校基金(QNYZ201510)；黔南州科技计划项目(黔南州科合社字(2015)2号)；贵州省卫生厅校科技联合基金(Gzwkj2012-2-018)。

姜艳萍(1963-)，实验师，主要从事化学实验教学及研究。

李春荣(1983-)，副教授，主要要从事分析化学教学及天然药物研究。

O657

A

1001-9677(2016)015-0118-03