三种方法提取益智挥发油的比较研究*

侯　杰，王　勇,，李永辉,，高炳淼，张俊清,，罗喻超

(1 海南医学院药学院，海南　海口　571199;2 海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南　海口　571199)



特稿

三种方法提取益智挥发油的比较研究*

侯杰1，王勇1,2，李永辉1,2，高炳淼2，张俊清1,2，罗喻超2

(1 海南医学院药学院，海南海口571199;2 海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南海口571199)

为了补充一种益智挥发油的提取方法，为益智挥发油质量控制及相关研究提供参考。采用水蒸气蒸馏法、溶剂提取法和超声波辅助提取法正交实验提取益智挥发油成分，用GC-MS对其进行鉴定，面积归一化法测定相对含量。结果表明，三种提取方法的最佳工艺，不同方法提取的益智挥发油外观性状和产率不同，不同方法提取的挥发油化学成分种类和相对含量有较大差异。超声波辅助提取法可以作为一种益智挥发油质量控制及相关研究的补充方法。

益智；挥发油；超声波辅助提取；质量控制

益智(Alpiniaoxyphylla)为姜科植物,主产于中国海南省，为海南四大南药之一。其成熟果实是益智的入药部分，据药典记载，益智性温味辛，归脾、肾经，具有温脾止泻、摄唾涎、暖肾、固精缩尿的功效[1]。益智挥发油挥发油具有抗菌、止泻、强心、镇痛、抗癌、拮抗钙活性、降血脂、利尿等功效[2-3]。益智药材挥发油化学成分的研究报道较多，陈新和吴惠勤等采用GC/MS鉴定了益智仁挥发油中的化合物[4-5]，易美华则分析了益智仁、茎、叶化学成分差异[7]。樊伟对益智仁乙醇提取物的抗氧化和抗肿瘤能力进行了评价，并分离纯化得到了7个化合物[8]。

对益智研究的文献较多，但药典中关于益智质量标准简单，2010 年版《中国药典》(一部)[1]中仅规定益智种子含挥发油不得少于1.0%(mL/g)，而对于药材标准中指标性成分的含量限度暂无规定，为益智药材质量标准指标性成分的含量提供参考，水蒸气蒸馏法提取挥发油在进行挥发性成分分析、药材的道地性研究及质量控制存在不足之处[6]，本实验通过三种方法提取益智果实挥发油成分，并利用GC-MS分析不同方法提取挥发油化学成分的差异，分析不同提取方法对挥发油化学成分的影响，为益智挥发油的研究及益智挥发油的质量控制提供新的补充提取方法。

1　实　验

1.1仪器与材料

GCMS-QP2010 Plus气相色谱-质谱联用，日本岛津公司；EYELA N-1100旋转蒸发仪，日本理化；电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；金坛科析HH恒温水浴锅，金坛科析仪器有限公司；DZF-6020恒温真空干燥箱，上海申贤恒温设备厂；DFT-200粉碎机，温岭市林大机械有限公司；挥发油提取器；索氏提取器。

益智仁、石油醚(AR)、无水乙醇(AR)。

1.2挥发油的提取及样品制备

水蒸气蒸馏法：取30 g益智粉置于圆底烧瓶中，选择粉碎度、浸泡时间、加水量、提取时间4因素运用L9(34)安排正交实验。使用挥发油提取装置提取挥发油，读取提取挥发油含量。

索式提取法：取30 g益智粉至于圆底烧瓶中，选择粉碎度、回流温度、加入石油醚量、提取时间4因素运用L9(34)安排正交实验。使用索氏提取器,称取高良姜粉末30 g，加入石油醚,加热回流提取，过滤提取液，45 ℃旋转蒸发挥干石油醚,收集挥发油并称重。

超声波辅助提取法：称取益智粉末30 g，选择粉碎度、超声功率、加入石油醚量、超声时间4因素运用L9(34)安排正交实验。使用超声波清洗机用石油醚提取3次，每次加入石油醚并置于超声波清洗器中开机处理，把3次的提取液合并过滤，45 ℃旋转蒸发挥干石油醚，收集挥发油并称重[9]。

样品的制备：上述每种方法最佳提取的挥发油样品用无水乙醇稀释制备3个样品溶液。

1.3气相色谱-质谱分析(GC-MS)

(1)色谱条件

色谱柱：Rxi—5 ms(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；柱箱温度：70 ℃ ；进样模式：分流；流量控制模式：线速度；压力：59.7 kPa；总流量：23.6 mL/min；柱流量：0.98 mL/min；线速度：36.3 cm/s；吹扫流量：3.0 mL/min；分流比：20.0；升温程序：70～130 ℃，3 ℃/min；130～190 ℃，2 ℃/min；190～250 ℃，6 ℃/min。

(2)质谱条件

离子源温度：230.00 ℃；接口温度：250.00 ℃；溶剂延迟时间：2.00 min；检测器增益方式：相对；检测器增益：0.88 kV+0.00 kV；阀值：1000

2　结果与讨论

2.1挥发油提取工艺优化

表1　水蒸气蒸馏法提取因素水平Table 1　Factors and levels of steam distillation

表2　水蒸气蒸馏法提取L9(34)正交实验结果Table 2　L9(34)orthogonal experimental results by steam distillation

表3　水蒸气蒸馏法提取正交实验方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment by steam distillation

注：F0.05(2,2)=19；*表示差异有统计学意义。

水蒸气提取正交实验测定结果见表2，方差分析见表3。由试验结果和方差分析显示，水蒸气提取各因素对提取的影响次序为B>D>A>C，即提取时间>加水量>粉碎度>浸泡时间。方差分析结果表明，在水蒸气提取益智挥发油的工艺中，药材的提取时间对得率有显著影响，加液量、粉碎度与浸泡时间则无显著影响。因此，为合理利用能源，考虑实际提取需要和条件，可确定蒸馏时间为8 h，加水量为400 mL。

根据正交实验结果，确定提取益智挥发油的最佳工艺是A3B3C1D2，即药材粉碎40目，提取时间8 h，浸泡时间6 h，加水量400 mL，以此工艺产率较高。

索式提取正交实验测定结果见表5，方差分析见表6。由试验结果和方差分析显示，索式提取各因素对提取的影响次序为A>C>B>D，即粉碎度>回流温度>提取时间>溶剂量。方差分析结果表明，在索式提取益智提取物的工艺中，粉碎度、对产率有显著影响。

表4　索式提取因素水平表Table 4　Factors and levels of solvent extraction

表5　索式提取L9(34)正交实验结果Table 5　L9(34)orthogonal experimental results by solvent extraction

表6　索式提取正交实验方差分析Table 6　Variance analysis of orthogonal experiment by solvent extraction

注：F0.05(2,2)=19；*表示差异有统计学意义。

根据正交实验结果，确定索式提取最佳工艺是A3B3C2D1，即药材粉碎40目，回流温度80 ℃，提取时间4 h，溶剂量300 mL，以此工艺得率较高。

表7　超声辅助提取因素水平表Table 7　Factors and levels of ultrasonic assisted extraction

表8　超声辅助提取L9(34)正交实验结果Table 8　L9(34)orthogonal experimental results by ultrasonic assisted extraction

表9　超声辅助提取正交实验方差分析Table 9　Variance analysis of orthogonal experiment by ultrasonic assisted extraction

注：F0.05(2,2)=19；*表示差异有统计学意义。

超声辅助提取正交实验测定结果见表8，方差分析见表9。由试验结果和方差分析显示，超声辅助提取各因素对提取的影响次序为A>C>D>B，即粉碎度>溶剂量>功率>提取时间。方差分析结果表明，在索式提取益智挥发油的工艺中，粉碎度、提取时间、超声功率、溶剂量对产率均无显著影响。

根据正交实验结果，确定超声辅助提取益智挥发油的最佳工艺是A3B2C2D1，即药材粉碎40目，提取时间4 h，溶剂量400 mL，超声功率15 kW，以此工艺产率高。

2.2挥发油GC-MS分析

图1　益智挥发性成分的总离子流Fig.1　Total ion current of volatile components of Alpinia oxyphylla

三种样品的总离子流见图1～图3，三种方法提取的挥发油中共有的化学成分为圆柚酮、芳樟醇、石竹烯、佛术烯、α-人参烯、长马鞭草烯酮、桉油烯醇、长叶醛、兰桉醇。三种方法提取挥发油中圆柚酮含量顺序为：超声波辅助提取、水蒸气提取、索氏提取。

水蒸气提取挥发油离子峰的成分含量较高的为对伞花烃、圆柚酮、桃金娘烯醛、1-甲基-4-(1-亚乙基)环己烯、α-蒎烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、氧化石竹烯、β-蒎烯、水芹烯、石竹烯、佛术烯、二表-α-雪松烯-1-氧化物、4-甲基(1-甲基乙基)-3-环己烯-1-醇、2-甲基-5-(1-甲乙基)苯酚、1,2,3,4-四氢-3-异丙基-5-甲基-1-萘酚、桉油烯醇等。其中对伞花烃和圆柚酮含量最高，这与Miao Q研究中的结果相同[10]。

与水蒸气提取物相比，超声提取物在保留时间小于20 min的挥发性成分缺失，但是在保留时间40～50 min之间含有水蒸气提取物所不含有的挥发性成分，超声辅助提取的成分中含量较高的有：圆柚酮、佛术烯、α-人参烯、兰胺醇、氧化石竹烯、长叶松香芹酮、香橙烯、桉油烯醇、4，5-脱氢异长叶烯、4a，5,6,7,8,8a-六氢化-6-[1-羟甲基-乙烯基]-4,8a-二甲基，2(1H)-萘酮等。

索氏提取物中的化学成分与水蒸气提取物中的成分和含量差异较大，其中索氏提取的成分中含量较高的有：4-4-羟基-3-甲氧基-2-丁酮、佛术烯、圆柚酮、石竹烯、α-人参烯、芳樟醇等。

3　结　论

(1) 三种提取方法中水蒸气提取的挥发油呈清亮的淡黄色；索氏提取物呈黑褐色；超声提取物呈黑褐色。从提取物颜色初步判断，超声提取和索氏提取物中杂质较多，此情况在GC/MS检测也得到了证实。

(2)在提取温度和提取时间上，超声波提取无需加热而且耗时少，弥补了水蒸气蒸馏操作温度高导致部分挥发油成分破坏的情况。超声辅助提取最佳工艺得到的挥发油量高于水蒸气提取，且超声波提取的挥发油成分中含有长叶松香芹酮、香橙烯、桉油烯醇、4，5-脱氢异长叶烯、4a,5,6,7,8,8a-六氢化-6-[1-羟甲基-乙烯基]-4,8a-二甲基等，这些化合物均未出现在水蒸气提取的化学成分中，这很好的补充了水蒸气提取挥发油不充分的不足。

鉴于水蒸气提取挥发油挥发性成分分析、药材的道地性研究以及质量控制存在的不足之处，超声波提取可以作为一种补充方法。

(3)关于超声波辅助提取含有部分脂肪酸成分有待今后进一步研究确定，而索氏提取物中化学成分和含量与水蒸气提取挥发油的差异较大，对于索氏提取物是否为挥发油还有待确定。

[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2010:273-274.

[2]阳辛凤,利美莲.益智成分，药理和毒理的研究进展[J].热带农业科学,1999(3):66-68.

[3]张俊清,王勇,陈峰,等.益智的化学成分与药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发, 2013,25(2):280-287.

[4]陈新,刘晓静,吴娇,等.益智果实挥发油化学成分及抑菌活性研究[J].中国农学通报,2010, 26(22):366-371.

[5]吴惠勤,黄晓兰,林晓珊,等.益智挥发油GC-MS指纹谱图研究[J].广西师范大学学报(自然科学版),2003,21(Z4):224-225.

[6]易美华,肖红,梁振益.益智仁、叶、茎挥发油化学成分的对比研究[J].中国热带医学, 2004,4(3):339-342.

[7]高素琴,朱春林.莪术挥发油提取工艺优化试验研究[J].时珍国医国药,2000,11(10):878-878.

[8]樊伟.益智仁抗氧化和抗肿瘤成分的分离与活性研究[D].南京:华东理工大学,2014.

[9]庞启华,何建华,曾润娟,等.不同方法提取高良姜挥发油的比较研究[J].药物生物技术, 2008,15(1):54-58.

[10]Miao Q, Kong W, Zhao X, et al. GC-FID coupled with chemometrics for quantitative and chemical fingerprinting analysis of Alpinia oxyphylla oil[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 102:436-442.

Comparison of Volatile Oil inAlpiniaoxyphyllaExtracted by Three Methods*

HOUJie1，WANGYong1,2，LIYong-hui1,2，GAOBing-miao2，ZHANGJun-qing1,2，LUOYu-chao2

(1 School of Pharmacy, Hainan Medical University, Hainan Haikou 571199;2 Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs, Hainan Haikou 571199, China)

To Compare the difference of volatile oil of the dryAlpiniaoxyphyllaextracted by different methods so as to supply data for quality control and research ofAlpiniaoxyphyllaMiq., volatile oil was extracted with orthogonal experiment of steam distillation, solvent extraction and ultrasonic assisted extraction. The compounds were identified by GC-MS and quantitatively determined with normalization method. Results showed that the optimum condition technology of three extraction methods, the color and yield of volatile oil were diverse. Difference was found in the kinds and relative content of component of volatile oil extracted by different methods. The ultrasonic assisted extraction can be used as a supplementary method of research and quality control ofAlpiniaoxyphyllaMiq. volatile oil.

Alpiniaoxyphylla; volatile oil; ultrasonic assisted extraction; quality control

国家自然科学基金(81560611)；海南省重大科技专项(ZDZX2013008-2)。

罗喻超，硕士，实验师，研究方向：分子药理学。

R9

B

1001-9677(2016)015-0001-04