呼吸道感染细菌联合疫苗体内实验研究

李树义，鲍承贤，张　敬

(1.河北省唐山市第九医院检验科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市双桥区疾病预防控制中心计免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站检验科，河北 唐山 063000)



·论著·

呼吸道感染细菌联合疫苗体内实验研究

李树义1，鲍承贤2，张敬3

(1.河北省唐山市第九医院检验科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市双桥区疾病预防控制中心计免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站检验科，河北 唐山 063000)

目的通过小鼠体内实验进行免疫学指标检测，观察其对机体免疫功能的影响，为研制我国呼吸道感染细菌联合疫苗提供理论依据。方法①分离培养我国小儿呼吸道感染常见6种细菌，按洗涤、超声波破碎、沉淀、透析、分光光度计测定等过程制备细菌蛋白，等量混合配成一定浓度作为实验用联合疫苗。②取无特定病原体级小鼠40只，随机分成4组，每组10只。全部实验小鼠饲喂基础日粮，适应性喂养10 d后，实验组分别用浓度为0.1、0.2、0.4 g/L联合疫苗免疫，每天上午灌服0.2 mL。对照组每天灌服0.2 mL生理盐水。免疫10 d。处死小鼠，分别测定联合疫苗组小鼠巨噬细胞吞噬功能、细胞免疫功能、血清中溶血素含量以及胸腺指数和脾脏指数的影响。结果联合疫苗组的巨噬细胞吞噬率和吞噬指数、左右后足质量差、溶血素吸光度值、脾脏指数和胸腺指数均显著高于对照组(P<0.05),在实验设计疫苗浓度范围各组中，不同组间检测值随疫苗浓度的增加而加大，且各实验组间也均存在明显差异(P<0.05)。结论制备的联合疫苗可提高机体免疫功能，不仅能提高细胞免疫功能，对体液免疫功能也具有明显影响，在实验浓度范围内，疫苗浓度越高对机体免疫功能影响越明显。

呼吸道感染；疫苗；免疫

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.020

细菌和病毒均可引起呼吸道感染，病毒感染后可继发细菌感染，临床治疗多应用抗生素，因药物品种的选择和剂量问题，可导致细菌产生耐药性或菌群失调。利用免疫制剂预防或治疗呼吸道感染，增强机体免疫力，是需要深入研究的课题[1-2]。兰菌净、泛福舒、必思添等制剂是将引起呼吸道感染的常见细菌经过特殊处理，制成的联合细菌混悬液。兰菌净由溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌B型制成，具有很好的抗原性，但由于地域、种族和不同的生活习惯，且制备兰菌净的细菌均来自英国菌株中心，其可能更适合欧洲白人应用；另外，进口疫苗价格昂贵，国内需自费接种，影响了此类疫苗的普及。所以，研制和生产一种针对我国预防和治疗呼吸道感染疾病的价格合理、效果更佳的疫苗势在必行。本研究以此为理论基础，制备呼吸道感染细菌联合疫苗，并通过体内实验，对联合疫苗的免疫学效果进行检测[3]。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康昆明种小鼠，无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级，体质量18～22 g，雌雄各半，购自北京军事医学科学院。实验用公鸡：由华北理工大学实验动物中心提供。取SPF级小鼠40只随机分成4组：正常对照组，联合疫苗1组，联合疫苗2组，联合疫苗3组，每组各10只。全部实验小鼠饲喂基础日粮，适应性喂养10 d后，分别用浓度为0.1、0.2、0.4 g/L联合疫苗免疫1组、2组、3组小鼠，每天上午灌服0.2 mL[4-5]；对照组小鼠每天灌服生理盐水0.2 mL。免疫10 d。根据实验要求处死小鼠，进行检测。

1.2主要试剂蛋白胨溶液(湖北兴银河化工有限公司)，氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司)，75%乙醇(沧州鑫安化工产品有限公司)。

1.3主要仪器设备HR60-ⅡA2生物安全柜(青岛海尔医用低温科技有限公司)，超声波破碎仪SONIFIER(北京星越天成科技有限公司)，高速台式离心机TGL-16B(上海安亭科学仪器厂)，电子精密天平CPA124S(上海恒磁电子科技有限公司)，台式离心机TDL-40B(上海安亭科学仪器厂)，全自动酶标仪SpectraPlus384(美国Molecular Devices公司)，分光光度计D-8PC(南京菲勒仪器有限公司)，光学显微镜CHC-212(日本奥林帕斯公司)。

1.4菌种来源由开滦总医院收集细菌，在华北理工大学微生物实验室分离培养。

1.5联合疫苗的制备从临床上分离培养呼吸道感染常见6种细菌(同兰菌净菌株)，等质量混合，然后装入无菌的离心管中，分别用生理盐水洗涤，用天平调平后，以3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，反复3次，取最后沉淀物用生理盐水稀释后，用超声波破碎仪将细菌分别破碎，用移液管加饱和硫酸铵到破碎细菌混合液中，混匀，沉淀细菌蛋白，利用透析膜除去硫酸铵，分光光度计测定蛋白含量，用细菌蛋白作为抗原[6]。按比例将抗原混合用0.9%生理盐水配置成实验要求浓度即为实验用联合疫苗。

1.6鸡红细胞悬液的制备将鸡翼下静脉取血部位用75%酒精消毒后，用注射器抽取静脉血，将鸡血置于肝素抗凝管中。然后取抗凝血3 mL加入装有12 mL生理盐水的离心管中，混匀后2 000 r/min离心15 min。弃掉上清，再在离心管中加入12 mL生理盐水，混匀后2 000 r/min离心15min。弃掉上清后，通过同样方法再洗涤1次，其沉积物即为鸡红细胞。随后立即取1 mL鸡红细胞加入9 mL生理盐水中，充分混匀，此溶液即为体积比为10%鸡红细胞悬液。

1.7巨噬细胞吞噬功能测定进行体外实验前每天9：00向小鼠腹腔内注入1%的蛋白胨溶液1次，共3次，末次注射24 h后，将1 mL 10%的鸡红细胞悬液注射入小鼠腹腔，30 min后，将小鼠颈椎脱臼处死，再向腹腔注入生理盐水2 mL，轻轻按摩小鼠腹部1 min。打开小鼠腹腔，吸取1 mL腹腔液，均匀涂在洁净载玻片上，37℃温箱孵育30 min。漂洗掉未贴片细胞，晾干，甲醇固定，用瑞氏染液浓染2 min，加入等量缓冲液淡染3 min，冲洗干净后晾干。显微镜下观察巨噬细胞吞噬情况，并按下式计算。吞噬率=(吞噬鸡红细胞的细胞数÷计数的巨噬细胞数)×100%。吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数÷计数的巨噬细胞数

1.8迟发型超敏反应测定适应性喂养各组小鼠2周后，将50 μL 10%(v/v)CRBC悬液注入每只小鼠的左后足掌，将等量生理盐水注射入右后足掌。待24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，沿相同部位切下小鼠双后足，用电子天平精确称其质量，计算左右后足质量差。

1.9血清溶血素含量测定取SPF级小鼠40只，按照1.6中分组及免疫小鼠，处死小鼠后摘除眼球取血，分离血清，用生理盐水稀释500倍待测。取稀释的血清1 mL，10%鸡红细胞0.5 mL，10%的补体1 mL，依次加入试管内，混匀。用混匀的稀释血清作对照，置37℃恒温水浴箱中反应30 min，然后移至冰浴中使反应终止，2 000 r/min离心10 min，取上清液于λ540 nm处比色测吸光度值。

1.10小鼠免疫器官指数测定电子天平分别称取小鼠体质量；滤纸吸干取出的脾脏、胸腺表面血液，用精密电子天平分别称其质量。免疫器官指数=脾脏(胸腺)质量(mg)/体质量(g)。

1.11统计学方法应用SPSS 13.0 软件包进行统计分析，计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

在实验设计疫苗浓度范围各组中，联合疫苗1、2、3组与对照组相比，联合疫苗2、3组与联合疫苗1组间相比，小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数、左右后足质量差、溶血素含量、脾脏指数和胸腺指数均显著提高(P<0.05)，见表1。

表14组各项观察指标比较

组别吞噬率(%)吞噬指数左右后足质量差(mg)溶血素D(λ)脾脏指数胸腺指数对照组 22.5±1.950.32±0.0216.50±2.120.205±0.0234.92±0.231.53±0.32联合疫苗1组27.3±1.65*0.46±0.02*21.60±2.07*0.229±0.018*5.64±0.30*2.16±0.24*联合疫苗2组30.24±2.10*#0.57±0.04*#23.36±2.65*0.236±0.022*5.93±0.28*#2.56±0.31*#联合疫苗3组35.29±2.65*#△0.65±0.05*#△25.63±3.02*#0.258±0.015*#△6.30±0.32*#△2.96±0.46*#△F 6.7814.9735.6253.9365.3057.582P 0.0010.0010.0010.0030.0010.001

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与联合疫苗1组比较△P<0.05与联合疫苗2组比较(SNK-q检验)

3　讨　　论

免疫制剂能调节机体免疫功能，减少不良反应，能有效地预防和治疗呼吸道感染。本研究利用引起小儿呼吸道反复感染的6种常见菌制备联合疫苗，进行动物体内实验，观察联合疫苗对机体免疫功能的影响。

巨噬细胞可识别和清除病原体等抗原性异物，参与和促进炎症反应，对肿瘤和病毒感染等靶细胞具有杀伤作用，可加工提呈抗原，启动适应性免疫应答，活化的巨噬细胞可通过分泌多种细胞因子，参与免疫调节[7]。细菌溶解产物能增强巨噬细胞的趋化作用，增加IL-2和IFN-γ的分泌量，提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，同时增强单个核细胞和多核细胞的吞噬功能[8-9]。实验联合疫苗的作用机制与兰菌净、泛福舒相似，可能是通过刺激巨噬细胞，增强淋巴因子释放，激活T淋巴细胞和促使B细胞向浆细胞成熟转化，T淋巴细胞产生淋巴因子、浆细胞使IgA和自然杀伤细胞活性增强，提高机体免疫力[10-11]；也可能是通过激活黏膜源性淋巴组织，使其分泌补体及细胞活素，刺激气管黏膜分泌免疫球蛋白，肺、肠分泌的IgA 浓度增加，提高呼吸道分泌型IgA(SIgA)及肺的巨噬细胞活性，通过特异性、非特异性细胞和体液机制增强免疫系统反应的效应，并可获得长期非特异性免疫保护作用，对反复呼吸道感染可起到预防和治疗的目的[12-13]。巨噬细胞是体内执行非特异性免疫作用的效应细胞，其吞噬指数是衡量机体非特异性免疫功能指标[14-15]。本研究结果显示，在实验浓度范围各组中，联合疫苗组与对照组相比，联合疫苗高浓度组与低浓度组间相比，小鼠的巨噬细胞吞噬率和吞噬指数得到明显提高。说明制备的联合疫苗可以提高小鼠巨噬细胞吞噬功能，促进正常小鼠非特异性免疫功能，且随浓度的升高免疫功能加强。

迟发型超敏反应也称Ⅳ超敏反应，为变态反应的一种。本研究采用鸡红细胞诱导小鼠迟发型超敏反应，观察小鼠左右后足质量差异(即足垫部肿胀程度)来衡量细胞免疫功能[16]。本研究结果显示，联合疫苗组小鼠左右后足质量差与对照组相比，实验高浓度组与低浓度组相比，检测数据均明显增高。说明制备的联合疫苗对小鼠细胞免疫功能具有促进作用，且随浓度的增高免疫功能增强。

溶血素是B淋巴细胞受抗原刺激后，分化成浆细胞产生的抗体。抗体是机体杀灭病原菌和清除外来抗原的重要活性物质，主要存在于体液中，是体液免疫反应的标志。本研究采用鸡红细胞免疫小鼠，致使小鼠血清溶血素抗体生成，其生成量可代表抗体生成总量，从而观察联合疫苗对小鼠体液免疫功能的影响[17]。溶血素与鸡红细胞、补体在37 ℃发生反应，鸡红细胞溶解。红细胞破裂释放出的血红蛋白使溶液变成红色，颜色越深，血红蛋白渗出量越多，且吸光度值与溶血素含量正相关，测定上清液的吸光度值，可间接反映血清中溶血素的含量，从而反映机体的体液免疫水平。本研究结果显示，联合疫苗组比对照组吸光度值显著增高，实验疫苗高浓度组与低浓度组相比吸光度值也明显增高。表明此联合疫苗可显著提高小鼠体液免疫功能，且随实验浓度的增高体液免疫功能增强。

免疫器官是实现免疫功能的器官或组织，是免疫细胞进行生长发育以及产生免疫应答的主要场所，当免疫器官生理性体积增大，免疫细胞数量增多，机体的免疫功能与抵抗力也会相对增强。因此，促进免疫器官质量增加，必定对机体免疫力起到提高的作用[18]。从本研究结果可以看出，用联合疫苗免疫后，小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著提高，随浓度的升高其检测指数也明显升高。说明联合疫苗可以促进机体免疫细胞增殖，提高机体免疫功能，且随浓度的升高而加强。

总之，通过一系列体内实验，证明利用呼吸道常见感染细菌制备的联合疫苗，对机体非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有明显提高，且在实验浓度范围内随疫苗浓度的升高而增强免疫力。同时证明利用我国上呼吸道感染的常见细菌，能够成功制备细菌联合疫苗，这为我国联合疫苗的研制提供了理论依据。

[1]张敬,朱丽华,张庆波.呼吸道感染细菌联合疫苗体外实验研究[J].实用预防医学,2015,22(6):746-748.

[2]朱颋,陈颖张.匹多莫德佐治小儿反复呼吸道感染疗效观察[J].临床合理用药,2015,8(11A):81-82.

[3]袁婷,关晓菲,马翠卿,等.A族链球菌M蛋白相关疫苗的研究进展[J].河北医科大学学报,2015,36(1):103-107.

[4]徐宗凯,林青青,周梦莹,等.三种李斯特菌菌体蛋白提取方法的比较[J].生命科学研究,2015,19(1):29-33.

[5]孙侠,韩长城,牛玉杰,等.溴氰菊酯对小鼠免疫系统的损伤作用[J].河北医科大学学报,2005,26(1):1-4.

[6]蔡岩,赵晓青,李继宏,等.乙型肝炎卡介苗联合疫苗免疫豚鼠及小鼠的病理学研究[J].微生物学杂志,2012,32(6):82-86.

[7]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al. Global cancer statistics,2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65( 2):87-108．

[8]Cazzola M,Anapurapu S,Page CP. Polyvalent mechanical bacterial lysate for the prevention of recurrent respiratory infections:a meta-analysis[J]. Pulm Pharmacol Ther,2012,25:62-68.

[9]洪建国.儿童反复呼吸道感染细菌提取物的临床应用[J].中国实用儿科杂志,2013,28(3):165-168.

[10]Rossi ME,Legal L,Azzari C,et al. Effect of a polyvalent bacterial preparation on nature kill cell activity in children with recurrent respiratory infections[J]. Int J Imumunotherapy,1993,9(4):225-233.

[11]赵志强,贾丽霞,张庆波,等.黄酮对免疫功能影响的体内研究[J].临床荟萃,2014,29(1):49-51.

[12]张伟.泛福舒辅助治疗儿童支气管哮喘的临床观察[J].中国医药指南,2015,13(13):70.

[13]吴永利,孔令茹,张洁,等.泛福舒治疗小儿反复呼吸道感染疗效观察[J].临床荟萃,2008,23(9):659-660.

[14]罗新舟,孙江桥.复方黄芪合剂对小鼠免疫功能影响[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(1):21-22.

[15]王秀青,孙慧敏,朱明,等.CecropinA-thanatin杂合肽对小鼠生长性能及免疫功能的影响[J].饲料研究,2015,8:65-70.

[16]刘印华,赵志强,李树义,等.黄芪多糖对免疫功能影响的体内实验研究[J].河北医药,2015,37(4):485-487.

[17]宋媛媛,周越,孙守兵,等.丁香苷对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用[J].中药药理与临床,2013,29(2):44-47.

[18]Hamada K,Sakaue M,Sarkar A,et al. Immune responses to repetitive adenovirus-mediated gene transfer and restoration of gene expression by cyclophosphamide or etoposide[J]. Gynecol Oncol,2005,99(3):177-186.

(本文编辑：刘斯静)

In vivo experimental study of bacteria combined vaccine in respiratory tract infection

LI Shu-yi1, BAO Chen-xian2, ZHANG Jing3

(1.Department of Clinical Laboratory,the Ninth Hospital of Tangshan City,Tangshan 063000, China;2.Department of Planned Immunization, Prevention and Control Center of Shuangqiao, Chengde 067000, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Blood Center of Tangshan City, Tangshan 063000, China)

ObjectiveThe immune function of the mice was detected through theinvivoexperiment in mice, which will provide theoretical basis for the development of the bacterial combined vaccine of respiratory tract infection in our country. Methods①Six common bacterias in children with respiratory tract infection in our country were isolated and cultured. Bacterial proteins were prepared by washing, ultrasonic crushing, precipitation, dialysis and spectrophotometer, and the equivalent amount of the mixture was used as the experimental combined vaccine. ②Forty specific pathogen free mice were randomly divided into four groups, with 10 rats in each group. All mice were fed with a basal diet.After adaptive feeding for 10 days, the experimental group were fed with concentrations of 0.1, 0.2, 0.4 g/L combined vaccine, with daily morning irrigation of 0.2 mL. The mice in normal control group were orally administered daily with physiological saline 0.2 mL. All groups were immuned for 10 days. Effects of combined vaccine on the phagocytic function of macrophage,the cellular immune function of mice, the changes of serum hemolysin content and the effect of thymus index and spleen index determinated. ResultsCompared with the normal control group, the macrophage phagocytic rate and phagocytic index,left and right foot weight, the absorbance value of serum hemolysin, the spleen index and thymus index of combined vaccine groups were significantly increased(P<0.05). In the experimental design of vaccine concentration range, the detection values in different groups were increased with the increasement of vaccine concentration, and there were significant differences among the test groups(P<0.05). ConclusionCombined vaccine can improve the immune function of organism. Combined vaccine can not only improve the cellular immune function, but also has obvious effect on humoral immune function. In the experimental concentration range, the higher the vaccine concentration, the more obvious effect on the immune function of the body.

respiratory tract infections； vaccines； immunity

2015-11-02；

2015-12-11

李树义(1974-)，男，满族，河北青龙人，河北省唐山市第九医院副主任检验师，医学硕士，从事临床检验学研究。

R517.6

A

1007-3205(2016)06-0693-04