甲泼尼龙对盐酸诱导急性肺损伤大鼠的保护作用

甄　洁，陈　炜*，朱　曦，边伟帅，赵　磊，盛　博

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院重症医学科,北京 100038；2.北京大学第三医院危重症医学科,北京 100191)



·论著·

甲泼尼龙对盐酸诱导急性肺损伤大鼠的保护作用

甄洁1，陈炜1*，朱曦2，边伟帅1，赵磊1，盛博1

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院重症医学科,北京 100038；2.北京大学第三医院危重症医学科,北京 100191)

目的探讨不同剂量甲泼尼龙对盐酸诱导急性肺损伤(acute lung injury，ALI)大鼠的保护作用。方法按随机数字表法将48只健康雄性SD大鼠分为模型组、对照组、小剂量甲泼尼龙干预组和大剂量甲泼尼龙干预组4组，每组12只。模型组经气管滴注盐酸(pH=1.8，2 mL/kg)，对照组给予等量生理盐水，小剂量甲泼尼龙干预组和大剂量甲泼尼龙干预组在制模后分别按5 mg/kg及40 mg/kg剂量腹腔注射甲泼尼龙。制模后4 h，光镜下观察肺组织病理改变，计算肺湿/干质量(W/D)比值，测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveloar lavage fluid,BALF)中蛋白含量、中性粒细胞比例(polymorphonuclear neutrophils, PMN%)及肺组织中Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA的相对含量。结果对照组肺组织结构清楚，肺泡间隔均匀，肺泡内无纤维蛋白渗出和中性粒细胞浸润。模型组可见支气管上皮细胞脱落、肺泡腔内大量纤维蛋白渗出及水肿液生成。小剂量甲泼尼龙干预组和大剂量甲泼尼龙干预组较模型组肺组织病理变化有不同程度改善。模型组、小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%均高于对照组，Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA水平低于对照组，小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组BALF中蛋白含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论甲泼尼龙可以明显改善盐酸诱导ALI大鼠的肺损伤程度，但小剂量甲泼尼龙较大剂量甲泼尼龙对肺保护作用更显优势。

急性肺损伤；甲泼尼龙；盐酸；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.008

吸入性肺炎，即误吸入酸性物质、食物、胃内容物以及其他刺激性液体和挥发性物质后，引起的化学性肺炎。常见于颅脑外伤、脑血管事件、酒精或药物等各种原因导致的意识状态改变的重症监护病房(intensive care unit，ICU)患者，严重者可发生呼吸衰竭、急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，甚至危及患者生命。研究显示，ARDS的病死率为10%～90%，其中吸入性肺炎相关的ALI、ARDS的病死率为30%[1-2]。 甲泼尼龙是一种中效糖皮质激素，具有强大的抗炎、抑制炎症因子释放及稳定细胞膜的作用。本研究通过建立盐酸诱导的ALI大鼠模型，探讨不同剂量甲泼尼龙在吸入性肺炎引起的ALI、ARDS治疗中的应用价值。报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠48只，体质量200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2012-0001。按随机数字表法分为4组：模型组、对照组、小剂量甲泼尼龙干预组和大剂量甲泼尼龙干预组，每组12只。

1.2主要药物和试剂盐酸(石家庄市试剂厂)；Trizgol试剂、通用引物、4种脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP)、核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)酶抑制剂、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶混合物、100 bp DNA分子梯度(天根生化科技有限公司)；逆转录酶(Promega公司)；特异性引物(北京赛百胜基因技术公司)。

1.3动物模型制备与处理模型组大鼠称质量后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰卧位固定，备皮、消毒后切开颈前正中皮肤，暴露气管，使大鼠呈头高脚低位，用7号针头刺入气管，缓慢滴注盐酸(pH=1.8，2 mL/kg)。注药完毕后，保持体位约2 min，缝合切口。对照组按同样方法给予等量生理盐水。小剂量甲泼尼龙干预组及大剂量甲泼尼龙干预组在模型制备后分别腹腔内注射小剂量甲泼尼龙(5 mg/kg)及大剂量甲泼尼龙(40 mg/kg)。

本研究实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4检测指标及方法

1.4.1标本收集所有大鼠给药4 h后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，开胸，心脏穿刺取血处死。游离右肺组织完整切除，取部分肺组织留检。游离主气管，做倒“T”字型切口，右主支气管结扎，行气管插管并固定后用4 ℃无菌生理盐水进行肺叶灌洗，回收全部灌洗液，离心(1 200 r/min，10 min)，上清液用于蛋白测定，细胞沉淀用于计算中性粒细胞比例。

1.4.2肺病理组织学观察部分肺组织用10%福尔马林溶液固定48 h后，常规进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。光镜观察肺组织病理学改变。

1.4.3肺湿/干质量比(W/D)测定取部分肺组织先测定湿质量后，放置烤箱(80 ℃)48 h，取出称干质量，计算W/D。

1.4.4支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量测定采用考马斯亮兰法测定BALF中蛋白含量。设置空白管、标准管和测定管，加入试剂后混匀，静置10 min，在紫外分光光度计(波长=595 nm，光径=1 cm)内调零空白管，测定各管吸光度值。计算公式如下：蛋白含量(g/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度(g/L)。

1.4.5BALF中中性粒细胞比例(polymorphonuclear leukocyte,PMN%)BALF中的细胞沉淀悬浮于200 μL生理盐水中，取部分涂片，HE染色后，光镜下根据细胞形态计数200个细胞，计数中性粒细胞所占的比例。

1.4.6逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测定肺组织中Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA的相对含量。取部分肺组织，用4 ℃生理盐水洗净血液，滤纸吸干水分后称质量，提取总RNA，合成cDNA，PCR扩增，进行Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA的相对含量测定。引物序列：α1上游引物5′- TCTGCGTCG-TGGTTCTTA-3′；α1下游引物5′- CTTGGGCTG-CGATTGGAT-3′；β-actin上游引物5′-CGTCGAC-ATGCGTAAAGAC -3′；β-actin下游引物5′-TTGAAGCTGGACTGTGAG -3′。β-actin为内对照，扩增片段长度201 bp，α1亚基扩增片段长度129 bp。反应条件：94 ℃预变性5 min,95 ℃变性45 s,51 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0 统计学软件分析数据，计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1肺组织病理形态学特点对照组肺组织结构清楚，肺泡间隔均匀，肺泡内无纤维蛋白渗出和中性粒细胞浸润；模型组可见支气管上皮细胞脱落、肺泡腔内大量纤维蛋白渗出及水肿液生成；小剂量甲泼尼龙干预组和大剂量甲泼尼龙干预组较模型组肺组织病理变化有不同程度改善。见图1。

2.2各组观察指标比较模型组、小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%均高于对照组(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA水平低于对照组(P<0.01)。小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组BALF中蛋白含量低于模型组(P<0.01)，小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组间BALF中蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、小剂量甲泼尼龙干预组、大剂量甲泼尼龙干预组间W/D值、PMN%、Na+-K+-ATP酶α1亚基mRNA差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表14组肺组织W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%和Na+-K+-ATP 酶α1亚基mRMA比较

组别 W/D值BALF中蛋白含量(g/L)PMN%Na+-K+-ATP酶α1-mRMA对照组 4.32±0.540.24±0.076.25±0.240.604±0.05模型组 5.12±0.15*0.99±0.37*20.20±5.18*0.306±0.03*小剂量甲泼尼龙干预组5.04±0.25*0.58±0.21*#19.00±7.17*0.554±0.10*大剂量甲泼尼龙干预组5.00±0.11*0.70±0.11*#17.75±4.89*0.539±0.09*F 16.91023.36019.50539.358P 0.0010.0000.0000.000

*P<0.01与对照组比较#P<0.01与模型组比较(q检验)

3　讨　　论

ICU收治的ARDS患者中，误吸引起的吸入性肺炎是常见原因之一[3]，其病死率高达40%～60%。吸入性肺炎引起ALI的机制可以分为2个阶段：第一阶段是酸性物质对肺泡及毛细血管膜造成直接损伤，由于吸入物质分布不均，这种损伤通常有局限性；第二阶段肺组织释放以肿瘤坏死因子α为代表的多种炎性介质，引起中性粒细胞(又称为趋化多核粒细胞)聚集、激活，诱发炎症反应，形成肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤[4]。吸入性肺炎所致ALI主要病理生理特点是局部肺组织坏死、肺泡结构损坏、肺毛细血管通透性增加、血清蛋白从肺泡毛细血管漏出肺泡腔及单核巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞聚集[5]。吸入物质的分布越广，损害程度越重。是目前危重症医学领域的治疗难点之一。

本研究通过气管内滴入盐酸模拟吸入性肺炎导致的 ALI,模型组BALF中的蛋白含量和肺组织W/D比值均明显升高，提示盐酸直接损害肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞，使其坏死脱落，肺泡毛细血管膜通透性升高，纤维蛋白渗漏至肺泡腔，大量水肿液生成，形成肺水肿。

中性粒细胞等炎症细胞的激活、聚集被认为是ALI中最重要的作用机制之一。中性粒细胞的积累、凋亡的延迟促使肺组织中多种炎性细胞因子呈“瀑布式”释放，引起肿瘤坏死因子α等炎症因子明显升高，使抗炎因子与炎性因子失衡，从而形成急性炎症损伤[6-7]。本研究中模型组PMN%明显升高，提示吸入性肺炎引起的ALI亦通过激活中性粒细胞造成严重的继发性损伤。这与陆战超等[8]的研究结果是一致的。

Na+-K+-ATP酶又称为钠泵,由α1、α2、β1亚基组成,在肺组织中主要分布于肺泡细胞膜上，在肺泡上皮液体的主动转运过程中起重要作用。本研究模型组肺组织中的 Na+-K+-ATP酶α1亚基表达水平显著低于对照组，可以推测 Na+-K+-ATP 酶基因表达水平下调、酶活性降低导致ALI肺组织处理钠水能力下降，从而影响肺水的吸收。

吸入性肺炎所致ALI发病机制复杂，损伤范围不均一，病变进展迅速，目前临床中常规治疗方法对ALI、ARDS预后改善尚无肯定的价值。糖皮质激素在ALI、ARDS的治疗中已有数十年的历史，但长期以来，国内外学者对糖皮质激素在ALI、ARDS中的应用时机、剂量、疗程及效果意见尚不统一。目前有研究表明，糖皮质激素不能控制ARDS病情进展[9]。有研究则认为ARDS晚期应用小剂量、长疗程的糖皮质激素能够改善预后、降低病死率[10-11]。本研究以甲泼尼龙作为糖皮质激素的代表，探讨其在吸入性肺炎引起的ALI、ARDS中的肺保护作用。

本研究结果显示，给予小剂量甲泼尼龙(5 mg/kg)干预后，与模型组比较，BALF中蛋白含量明显降低。其机制可能是：甲泼尼龙可以直接改善肺组织血管通透性，抑制血管内皮细胞凋亡，减少纤维蛋白漏入组织间隙。

甲泼尼龙干预后，另一有显著改善的指标是Na+-K+-ATP 酶α1亚基mRNA的表达水平。丁新民等[12]研究证明地塞米松抑制Na+-K+-ATP 酶活性的下降。本研究结果与其一致。由此可以推测，Na+-K+-ATP 酶α1亚基mRNA的表达增加可能是酶水解活性增加的原因之一，Na+-K+-ATP 酶活性增加可调节肺水的吸收。经激素干预后，虽然Na+-K+-ATP 酶α1亚基mRNA表达水平有所升高，但是本研究中激素干预组仍有部分大鼠组织病理学无明显改善，光镜下仍可见肺泡腔内大量含有纤维蛋白的水肿液，这提示肺水肿液的生成和调节除了 Na+-K+-ATP酶参与外，还有其他途径，如水通道蛋白参与了肺水的转运[13]，其具体机制有待进一步研究。

本研究甲泼尼龙干预后，2个甲泼尼龙干预组BALF中PMN%与模型组比较差异无统计学意义。分析其原因可能是：①盐酸吸入诱导的ALI损伤过程分为直接性损伤及继发性损伤2个时相，甲泼尼龙干预时间早晚可能对PMN的抑制作用有直接影响；②糖皮质激素通过与糖皮质激素受体结合起到抗炎作用，ALI时糖皮质激素受体结合能力下降[14]；③Shi等[15]研究发现糖皮质激素能促进炎症介质释放，因此提示激素在不同情况下对炎症反应的影响并不一致，但其机制尚不明确。

本研究应用2种不同剂量甲泼尼龙进行干预，小剂量甲泼尼龙在改善盐酸吸入所致ALI蛋白渗出、肺水形成等方面作用显著，但是大剂量甲泼尼龙对各项指标改善均差异无统计学意义，提示小剂量甲泼尼龙对ALI有保护作用。有研究证实小剂量糖皮质激素能显著抑制ARDS时的炎症反应，提高生存率[16]。

盐酸吸入诱导的大鼠ALI模型虽然在一定程度上模拟了吸入性肺炎引起的ALI，但与临床情况仍存在一定差别。胃内容物包括盐酸、蛋白酶等多种物质，吸入物的成分、数量和性质不同，对肺组织造成的损伤程度也不尽相同。甲泼尼龙可以减轻盐酸吸入所致ALI的肺毛细血管损伤、减轻肺水肿的形成，表明其对吸入性肺炎所致的ALI、ARDS存在一定的临床应用价值，但由于本研究中甲泼尼龙的具体剂量、作用时相及实验模型的选择局限性，其在ALI中的具体作用机制还需深入探讨。(本文图见封三)

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(本文编辑：赵丽洁)

The protective effects of Methylprednisolone on rats with HCl-induced acute lung injury

ZHEN Jie1, CHEN Wei1*, ZHU Xi2, BIAN Wei-shuai1, ZHAO Lei1, SHENG Bo1

(1.Department of Intensive Care Unit, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing100038, China; 2.Department of Intensive Care Vnit, the Third Hospital ofPeking University, Beijing 100191, China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of different doses of methylprednisolone(MP) on HCL-induced acute lung injury in rats. MethodsA total of 48 male SD rats were divided randomly into four groups according to the random number table method:model group, control group, small-dose MP group and high-dose MP group. Each group included 12 rats. The model group were injected with hydrochloric acid(pH=1.8, 2 mL/kg) by the endotracheal intubation, and the control group were injected with equal volume of normal saline by the endotracheal intubation. The small-dose MP group and high-dose MP group were intraperitoneally injected with 5 mg/kg and 40 mg/kg MP after duplicating model. Four hours after duplicating model, the pathological changes of lung tissue were observed under light microscope. The lung wet/dry ratio(W/D) was calculated. Protein concentration, PMN% in bronchoalveloar lavage fluid and the expression of Na+-K+-ATPase α1isoforms mRNA in lung tissues were measured. ResultsIn the control group, the lung tissue structure was clear, the alveolar septum was uniform, and there was no fibrin exudation and neutrophil infiltration in the alveolar. Model group showed the bronchial epithelial cells, alveolar cavity, a large number of fibrin exudation and edema fluid formation. Compared with model group, there were different degrees of improvement of the lung tissue pathologic characteristics in the small-dose MP group and high-dose MP group. In model group，small-dose MP group and high-dose MP group, W/D，protein concentration and PMN% in BALF were significantly increased， the Na+-K+-ATPase α1isoforms mRNA expressions were significantly lower. and the protein concentrations in BALF in small-dose MP group and high-dose MP group were significantly decreased, compared with control group. The difference was statistically significant (P<0.01). ConclusionMP can significantly improve lung injury degree of hydrochloric acid-induced acute lung injure model of rats. Small-dose MP has more advantage on lung protection than high-dose MP on acute lung injury of rats.

acute lung injury； methylprednisolone； hydrochloric acid； rats

2016-04-18；

2016-05-20

国家自然科学基金(81372043)；首都医科大学附属北京世纪坛医院青年博士基金课题项目(2012-QB14)

甄洁(1981-)，女，河北涞水人，首都医科大学附属北京世纪坛医院住院医师，医学硕士，从事危重症诊治研究。

。E-mail:hanwa@aliyun.com

R563.9

A

1007-3205(2016)06-0647-06