3种不同脑区定点注射6-OHDA单侧损伤大鼠帕金森病模型的比较研究

李　进，孙　杰，赵　楠，吴　钧，刘　俊，马　钢

(云南省昆明市第一人民医院神经外科，云南 昆明 650011)



·论著·

3种不同脑区定点注射6-OHDA单侧损伤大鼠帕金森病模型的比较研究

李进，孙杰，赵楠，吴钧，刘俊*，马钢

(云南省昆明市第一人民医院神经外科，云南 昆明 650011)

目的从神经行为学、组织病理和生化方面对3种不同脑区单侧定点注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)损伤大鼠帕金森病(Parkinson disease，PD)模型进行比较研究。方法健康雄性SD大鼠随机分为3组(n=10)：纹状体组、黑质组、黑质+中脑腹侧被盖区组。根据脑立体定位图谱，将微量6-OHDA单点定位注入大鼠中脑黑质区、纹状体区和双点定位注入黑质区与中脑腹侧被盖区。观察阿朴吗啡诱发大鼠旋转行为, 免疫组织化学检测大鼠黑质区酪氨酸(tyrosinehydroxy-lase，TH+)阳性神经元数目，电化学高效液相色谱法检测纹状体中多巴胺(dopamine，DA)及其代谢产物3,4-二羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)含量。结果纹状体组3周后模型稳定，黑质组与黑质+中脑腹侧被盖区组大鼠2周后稳定， 3组30 min内向健侧转圈数均呈升高趋势，黑质+中脑腹侧被盖区组高于纹状体组和黑质组，组间·时点间交互作用差异有统计学意义(P<0.05)。纹状体组和黑质+中脑腹侧被盖区组造模成功率高于黑质组(P<0.05)。3组大鼠注射6-OHDA损伤侧纹状体中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神经元数目均明显低于非损伤侧(P<0.05)。结论纹状体单点注射6-OHDA损伤建立PD模型成功率高，可作为研究PD的一种稳定可靠的动物模型。

帕金森病；羟基多巴胺类；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.013

帕金森病(Parkinson disease,PD)是常见于老年人并有向中年移行趋势的一种神经退行性疾病，其典型的病理特征为中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元缺失以及黑质纹状体通路中DA数量降低。在PD的研究中，研究者创建和发展了诸多模型，主要有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1- methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyritine, MPTP) 模型、6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA) 模型、百草枯模型和鱼藤酮、模型等[1]。6-OHDA诱发的PD动物模型在神经生化、病理和行为学方面与人类PD具有很大相似性，已被广泛用于PD的研究。然而，6-OHDA诱导PD神经退行性变性的程度和特点明显受注射部位的影响[2]。因此，本研究通过3种不同脑区定点注射6-OHDA单侧损伤建立大鼠PD模型，从行为学、组织病理和生化方面进行比较，旨在为PD研究提供稳定可靠的动物模型。报告如下。

1　材料与方法

1.1动物来源及分组无特定病原体级雄性SD大鼠，体质量(270±20) g，购于并饲养于昆明医学院实验动物中心，室内温度保持在(23±2) ℃，房间保持12 h昼夜节律，动物自由进食水。实验中所有操作均遵循美国国立卫生研究院及昆明医学院实验动物伦理委员会的规定。健康雄性SD大鼠随机分为3组(n=10)：纹状体组、黑质组、黑质+中脑腹侧被盖区组。

1.2实验仪器和试剂倒置荧光显微镜(OLYMPUS)；高效液相库仑阵列电化学检测系统(ESA公司，美国)；Agilent C18反相色谱柱、台式高速冷冻离心机、冰冻切片机、啮齿类动物脑立体定位仪(瑞沃德生命科技有限公司)。6-OHDA、阿扑吗啡均购自Sigma公司；Anti-TH兔抗鼠单克隆抗体、MPTP、GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒购自基因科技(上海)有限公司；多聚甲醛、二甲苯、无水乙醇等购自广州化学试剂厂。

1.3模型建立手术前饥饿12 h，大鼠称体质量、编号后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，头颅水平位固定在脑立体定位仪上，头顶部去毛，碘液清洁消毒头部皮肤，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟，以前囟为准，依SD大鼠立体定向脑图谱[2]确定注射坐标。纹状体组坐标确定：A/P(距前囟中心后)0 mm； L/R(距前囟中心左右)-3 mm；O/V(距脑膜表面深度)：-5.5 mm、-4.5 mm。黑质组坐标确定：A/P -5.2 mm； L/R -1.8 mm；O/V -7.8 mm。黑质+中脑腹侧被盖区组坐标确定：AP -5.2 mm； L/R 1.8 mm；O/V -7.8 mm；A/P -4.6 mm； L/R -0.9 mm；O/V -7.8 mm。

按照上述坐标用10 L微量进样器向3个实验组坐标注射6-OHDA(溶于0.1%维生素C中，浓度为4 g/L)。纹状体组：单点注射2.5 L。黑质组：单点注射4 L。黑质+中脑腹侧被盖组：双位点注射，每点注射2 L。注射速度为1 L/min。注射完毕后留针10 min，以1 mm/min 速度缓慢旋转退针，止血，缝合皮肤, 碘酒消毒。术后连续3 d肌内注射青霉素纳50万U预防感染。大鼠清醒后置于笼内正常环境饲养。

1.4行为学转圈实验手术后2周腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)，在空旷处预观察10 min，如果大鼠开始向健侧转圈，记录30 min内的转圈数，每周1次，连续测量3周，如果30 min 内转圈数大于210次，则模型视为成功，记录3种模型大鼠在每周的转圈次数。

1.5电化学高压液相系统检测采用电化学高压液相系统检测脑组织中DA、3,4-二羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸(Homovanillic acid，HVA)含量[3-4]。每组大鼠按照以上方法造模和给药，水合氯醛麻醉，断头后迅速取出大脑。在冰浴条件下分离取出双侧纹状体。组织称质量后每一组织加入 0.1 mol/L高氯酸提取液，冰浴匀浆后12 000 r/min离心15 min，取上清备用。采用Agilent C18反相色谱柱(150 mm×3 mm，4.6 μm), 流动相为甲醇/水=10∶90，水相中每升含有0.05 mol/L NaH2PO47.8 g，0.027 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)8 mg，0.74 mmol/L辛烷磺酸钠，2 mmol/L氯化钾，流量1 mL/min，柱温33 ℃，检测电压0.52 V，流动相pH调节为3.5，精确吸取20 μL注入色谱仪分析，以各标准品的浓度为横坐标(X)、各组分的峰面积为纵坐标(Y)进行回归分析，得到标准曲线。

1.6免疫组织化学检测检测脑黑质致密部中酪氨酸阳性(tyrosinehydroxy-lase，TH+)神经元数目。实验结束时，用10%水合氯醛麻醉动物，灌流、固定。从左心室进针，右心耳剪“V”形切口，先灌注血管冲洗液(磷酸盐缓冲液 1 000 mL，1 % NaNO22 mL，肝素0.02 g和NaCl 9 g)冲洗至流出的液体为无色，换冰冷的4%多聚甲醛(溶解于0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液)继续灌流固定。取出预固定的全脑组织，按照质量/体积比(10∶1)置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃后固定过夜。然后经磷酸盐缓冲液洗净后，逐步放入10%、20%、30%的梯度sucrose溶液中，待组织完全沉底后，将包埋剂包埋的脑组织进行冰冻切片(黑质区取前囟后3.3～5.3 mm区域)，厚度25 μm，整个黑质可切片80张左右。0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=6.0)微波抗原修复，高火5 min，中低火10 min，自然冷却后，3% H2O2避光反应 10 min去除内源性的过氧化物酶, 1%TritonX-100通透切片 30 min，10% 马血清封闭 1 h，TH+一抗4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；DAB工作液显色，自来水终止显色反应。70%、80%、90%、100% 梯度酒精依次脱水，每次3 min；二甲苯透明2次，每次5 min。最后用中性树脂封片。倒置显微镜下计算小鼠TH+神经元的数目。每只大鼠从前往后选10张位置对应的切片用体视学网格计数黑质致密部TH+神经元数目，作为评价指标。

1.7统计学方法应用SPSS 19.0 统计软件包进行数据分析。计量资料比较分别采用单因素方差分析、q检验、配对t检验及重复测量设计资料的方差分析；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.13组大鼠转圈比较纹状体组大鼠手术2周后转圈行为不明显，大鼠转圈时间< 30min或者转圈时容易停顿很久，但是3周后模型基本稳定，转圈很稳定。黑质+中脑腹侧被盖区组和黑质组大鼠模型2周后已经稳定。3组30 min内向健侧转圈数均呈升高趋势，黑质+中脑腹侧被盖区组高于纹状体组和黑质组，组间、时点间差异无统计学意义(P>0.05)，组间·时点间交互作用差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

4周时纹状体组大鼠造模成功率为100.0%，黑质+中脑腹侧被盖区组为60.0%，黑质组为30.0%，纹状体组和黑质+中脑腹侧被盖区组造模成功率高于黑质组，差异有统计学意义(χ2=10.622，P=0.005)。

表13组大鼠手术2～4周30 min内向健侧转圈数比较

组别 转圈数2周3周4周纹状体组237.6±156.6351.8±157.5360.8±99.1黑质组334.3±17.8349.0±50.9359.5±38.9黑质+中脑腹侧被盖区组390.3±50.2392.0±31.2423.7±103.5组间F=0.950 P=0.413时点间F=1.450 P=0.253组间·时点间F=3.370 P=0.006

2.23组大鼠纹状体中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神经元数目比较3组大鼠注射6-OHDA损伤侧纹状体中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神经元数目均明显低于非损伤侧(P<0.05)。3组间非损伤侧和损伤侧DA含量和TH+神经元数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)；黑质组非损伤侧DOPAC含量高于纹状体组和黑质+中脑腹侧被盖区组，黑质组和黑质+中脑腹侧被盖区组损伤侧DOPAC含量高于纹状体组，黑质组和黑质+中脑腹侧被盖区组非损伤侧HVA含量高于纹状体组，黑质组损伤侧HVA含量高于纹状体组和黑质+中脑腹侧被盖区组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表23组DA、DOPAC、HVA、TH+神经元数目比较

组别 DA(ng/mg)非损伤侧损伤侧DOPAC(ng/mg)非损伤侧损伤侧HVA(ng/mg)非损伤侧损伤侧TH+神经元数目(个/切片)非损伤侧损伤侧纹状体组16.8±7.40.5±0.1*3.1±0.70.2±0.1*1.6±0.50.1±0.1*152±1018±10*黑质组22.3±5.60.6±0.2*5.8±0.7#0.4±0.1*#2.1±0.3#0.4±0.1*#162±2713±4* 黑质+中脑腹侧被盖区组17.9±7.20.6±0.8*3.6±0.2△0.3±0.1*#2.1±0.1#0.1±0.0*△153±619±10* F1.8420.14560.68610.0007.14330.0001.0521.435 P0.1780.8660.0000.0000.0030.0000.3630.256

*P<0.05与非损伤侧比较(配对t检验)#P<0.05与纹状体组比较△P<0.05与黑质组比较(q检验)

3　讨　　论

PD为继阿尔茨海默病后第2个常见的神经退行性疾病，65岁以上的人群发病率为1%～2%[5]。这种疾病的特点是黑质致密部的多巴胺能神经元损毁50%～70%，即纹状体DA严重缺失[6]。开展动物模型研究可以更好地了解PD的病因、发病机制、分子机制和潜在的治疗策略。

PD动物模型最相关的包括：选择性地破坏儿茶酚胺系统的神经毒性化学作用剂如6-OHDA、1-甲基-1,2,3,6-四氢呋喃、鱼藤酮和百草枯(农药杀虫剂)、炎症调节剂、泛素-蛋白酶体系统抑制剂等模型；几个基因操控模型如α突触核蛋白、DJ-1、PINK1 (PTEN induced putative kinase 1)、Parkin、富含亮氨酸报告激酶2转基因或基因敲除动物[7]。到目前为止，应用神经毒素选择性破坏儿茶酚胺系统引起动物DA能神经元损毁是研究PD的动物模型复制使用最广泛的方法。

6-OHDA是一种DA羟基化类似物。Tranzer 等[8]发现6-OHDA能够选择性诱导交感肾上腺素能神经未梢变性，由此引导出“化学去神经”的神经生物学新概念。目前，这种神经毒性分子在神经生物学中被广泛用于损毁黑质纹状体DA系统，作为PD模型复制最常用的一种工具[1]。6-OHDA在大脑中能诱导DA能和去甲肾上腺素能神经元变性[9]。因为6-OHDA在结构上与DA和去甲肾上腺素类似，在质膜上的转运体、DA转运体和去甲肾上腺素转运体都对6-OHDA具有高度亲和力[10]。一旦进入神经元内，6-OHDA积聚在胞浆被快速氧化产成活性氧，最终引起氧化应激相关的细胞毒性[11-12]。因此，这2种神经元特别容易受到损毁。在使用6-OHDA之前给予选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂(去甲丙咪嗪或丙咪嗪)，阻止这些动物发生去甲肾上腺素能神经元损伤[ 10]。本研究结果显示，电化学高效液相色谱法检测纹状体中DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量显著减少。

单侧注射6-OHDA后能引起明显的黑质纹状体通路的顺行性变性[11-12]。这个变性首先开始在黑质TH+神经元，随后TH+纹状体的DA能接头损失，以及相关的DA耗竭[12]。纹状体退行性变性时显示TH+纹状体末梢死亡先于黑质TH+神经元，表明复制了人类PD的病理过程[12]。一些证据表明在PD的初始病理部位始于纹状体，“未梢死亡”的轴突病变导致黑质退行性病变和神经细胞损失[13]。6-OHDA模型可导致DA耗竭、黑质DA神经元损失和行为缺陷[14]。本研究结果显示，免疫组织化学检测大鼠损伤侧黑质区TH+神经元数目显著减少，表明DA神经元死亡增加，其数目严重缺失。

6-OHDA不能通过血脑屏障，通常需要通过立体定向头架定点直接局部注射到黑质致密区或内侧前脑束，这区域由黑质神经细胞体到纹状体或纹状体的传出纤维构成，在那里6-OHDA特异性地杀死DA 和去甲肾上腺素神经元[11]。通常在6-OHDA损毁神经元几周后，大鼠出现自发性旋转[10，15]，继这种单侧毁损后，全身注射DA受体激动剂(阿朴吗啡)、3,4-二羟基苯丙氨酸(左旋多巴，DA的前体)或DA释放化合物(苯丙胺)诱导发生不对称旋转。黑质纹状体病变的大小与旋转运动的行为有关[16]。因此，动物出现自发性旋转是评价PD动物模型成功建立的一项重要指标。

6-OHDA 诱导神经退行性变性的程度和特点显著受到注射部位的影响[4]，最常在单侧被注射到黑质、内侧前脑束或纹状体3个区域。一般神经末梢对6-OHDA毒性比轴突和细胞体更敏感[17]，当注射到黑质或前脑内侧束时，6-OHDA在黑质纹状体通路产生完整且快速的损伤病变。当6-OHDA被注射到黑质，DA神经元变性发生在12 h内，而纹状体的末梢明显损失出现在2～3 d后[18]。6-OHDA注射到内侧前脑束时，6-OHDA诱导纹状体末梢变性，先于DA细胞发生死亡前[19]。与黑质和内侧前脑束相比，6-OHDA到达纹状体时诱导缓慢、渐进和部分的黑质纹状体结构损伤，持续3周时间[20]。本研究结果显示，纹状体单点注射大鼠3周后出现稳定转圈且造模成功率高，黑质单位点注射及黑质与中脑腹侧被盖区双位点注射大鼠2周后出现稳定转圈，但造模成功率低。表明6-OHDA纹状体单点注射大鼠模型建立成功率高，可作为建立PD动物模型稳定可靠的方法。

综上所述，6-OHDA纹状体单点注射方法主要优点：①进展性和广泛损失病变与PD有关；②这种方案可以产生PD的运动神经症状；③立体定向注射到纹状体，增加PD模型成功的可能性；④对动物量化异常转圈运动具有独特效果；⑤单侧注射损伤一个大脑半球，剩下另一未有损伤病变的大脑半球可作为内部对照。因此，6-OHDA注射单侧损伤大鼠PD模型广泛用于临床前抗PD作用、新的药物治疗神经保护作用以及临床改善细胞移植作用的评估研究。

[1]Yun JW,Ahn JB,Kang BC. Modeling Parkinson's disease in the common marmoset(Callithrix jacchus): overview of models,methods,and animal care[J]. Lab Anim Res，2015，31(4):155-165.

[2]Bil M,Huybrechts R. Pharmacological regulation of digestion in the anautogenous flesh fly,Sarcophaga crassipalpis,by simple injection of 6-ydroxydopamine[J]. Arch Insect Biochem Physiol,2016,91(3):137-151.

[3]Gal S,Zheng H,Fridkin M,et al. Novel multifunctional neuroprotective iron chelator-monoamine oxidase inhibitor drugs for neurodegenerative diseases. In vivo selective brain monoamine oxidase inhibition and prevention of MPTP-induced striatal dopamine depletion[J]. J Neurochem,2005,95(1):79-88.

[4]李军伟,胡国新,王萍. HPLC-ECD 法检测小鼠体内多巴胺及其代谢产物[J].广东微量元素科学,2012,18(11):32-36.

[5]Recasens A,Dehay B. Alpha-synuclein spreading in Parkinson's disease[J]. Front Neuroanat,2014,8:159.

[6]Klingelhoefer L,Reichmann H. Pathogenesis of Parkinson disease-the gut-brain axis and environmental factors[J]. Nat Rev Neurol,2015,11(11):625-636.

[7]Morroni F,Tarozzi A,Sita G,et al.Neuroprotective effect of sulforaphane in 6-hydroxydopamine-lesioned mouse model of Parkinson's disease[J]. Neurotoxicology,2013,36:63-71.

[8]Tranzer JP,Thoenen H. Selective destruction of adrenergic nerve terminals by chemical analogues of 6-hydroxydopamine [J]. Experientia,1973,29(3):314-315.

[9]Matheus FC,Rial D,Real JI,et al. Decreased synaptic plasticity in the medial prefrontal cortex underlies short-term memory deficits in 6-OHDA-lesioned rats[J]. Behav Brain Res,2016,301:43-54.

[10]Bar-Am O,Amit T,Kupershmidt L,et al. Neuroprotective and neurorestorative activities of a novel iron chelator-brain selective monoamine oxidase-A/monoamine oxidase-B inhibitor in animal models of Parkinson's disease and aging[J]. Neurobiol Aging，2015,36(3):1529-1542.

[11]Dias V,Junn E,Mouradian MM.The role of oxidative stress in Parkinson's disease[J]. J Parkinsons Dis,2013,3(4):461-491.

[12]Wei X,He S,Wang Z,et al. Fibroblast growth factor 1attenuates 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity: an in vitro and in vivo investigation in experimental models of Parkinson's disease[J]. Am J Transl Res,2014,6(6):664-677.

[13]Chu Y,Morfini GA,Langhamer LB,et al. Alterations in axonal transport motor proteins in sporadic and experimental Parkinson's disease[J]. Brain,2012,135(Pt 7):2058-2073.

[14]Schwarting RK,Huston P. Unilateral 6-hydroxydopamine lesions ofmeso-striatal dopamine neurons and their physiological sequelae[J]. Prog Neurobiol,1996,49(3):215-266.

[15]Blandini F,Armentero MT. Animal models of Parkinson's disease[J]. FEBS J,2012,279(7):1156-1166.

[16]Singh A,Liang L,Kaneoke Y,et al. Dopamine regulates distinctively the activity patterns of striatal output neurons in advanced parkinsonian primates[J]. J Neurophysiol,2015,113(5):1533-1544.

[17]Paumier KL,Sortwell CE,Madhavan L,et al.Chronic amitriptyline treatment attenuates nigrostriatal degeneration and significantly alters trophic support in a rat model of parkinsonism[J]. Neuropsychopharmacology,2015,40(4):874-883.

[18]Wang JY,Yang JY,Wang F,et al. Neuroprotective effect of pseudoginsenoside-f11 on a rat model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:152798.

[19]Roseberry AG. Acute fasting increases somatodendritic dopamine release in the ventral tegmental area[J]. J Neurophysiol,2015,114(2):1072-1082.

[20]Segura-Aguilar J,Muoz P.Paris I.Aminochrome as new preclinical model to find new pharmacological treatment that stop the development of Parkinson's disease[J]. Curr Med Chem,2015，23(4)：346-359.

(本文编辑：赵丽洁)

Comparative study of Parkinson disease rat model via unilateral injection of6-OHDA into three different brain regions

LI Jin, SUN Jie, ZHAO Nan, WU Jun, LIU Jun*, MA Gang

(Department of Neurosurgery, the First People's Hospital of Kunming City，Yunnan Province, Kunming 650011, China)

ObjectiveTo compare Parkinson disease(PD) rat models via unilateral injection of 6-hydroxydopamine(6-OHDA) into three different brain regions from the aspects of neurobehavior, histopathology and biochemistry. MethodsHealthy male SD rats were randomly divided into three groups(n=10):striatum group， substantia nigra group，substantia nigra+ midbrain ventral tegmental area group. According to the stereotaxic atlas of the brain, the trace 6-OHDA unilateral injection into rat substantia nigra and striatum were performed via single point position in striatum group and in substantia nigra group, and 6-OHDA injection into rat substantia nigra and midbrain ventral tegmental area were performed by double point position in substantia nigra+midbrain ventral tegmental area group.The rotation behavior induced by apomorphine was observed in rats. The tyrosine positive neurons in the rat substantia nigra were detected by immunohistochemistry. The dopamine(DA) and its metabolic products 3, 4 dihydroxy phenyl acetic acid(DOPAC) and homovanillic acid(HVA) were measured by electrochemical high-performance liquid phase chromatography in rat striatum. ResultsIn the rats with unilateral injection 6-OHDA into striatum viasingle point position, stablerotation appeared at 3 weeks, and a high rate of success in animal model was obtained. In the rats with substantia nigra injection model viasingle point and in the rats with substantia nigra + midbrain ventral tegmental area via double point position injection model, stable rotation appeared after 2 weeks, but animal model success rate is low. Three types of PD rat models in different brain regions injected by 6-OHDA showed that the number of tyrosinehydroxy-lase neurons in substantia nigra area was severely deficient, and that the contents of DA and its metabolites(DOPAC, HVA) in striatum were significantly decreased. ConclusionRat model with unilateral injection 6-OHDA into striatum via single point position is highly successful, which can be used as a stable and reliable animal model for the study on PD.

Parkinson disease; hydroxydopamines; rats

2016-01-25；

2016-02-15

云南省教育厅科学研究基金(2013C227)

李进(1978-)，男，湖北黄冈人，云南省昆明市第一人民医院主治医师，医学硕士，从事神经外科疾病诊治研究。

。E-mail：15877991837@163.com

R7742.5

A

1007-3205(2016)06-0667-05