纳米脂肪改善裸鼠光老化皮肤质地的实验研究

黄惠真 李伟 许鹏 于倩 张文杰 林晓曦

·论著·

纳米脂肪改善裸鼠光老化皮肤质地的实验研究

黄惠真 李伟 许鹏 于倩 张文杰 林晓曦

目的 初步探讨纳米脂肪改善紫外线诱导的光老化裸鼠皮肤质地的作用和机理，为纳米脂肪在临床中应用于皮肤光老化治疗提供相关证据。方法 选用6～8周龄雌性BALB/c裸鼠18只，分为4组：Control组（不行任何干预，n＝6），PBSUVB组 （紫外线照射+PBS注射），ADSCs-UVB组 （紫外线照射+ADSCs注射，n＝6），Nanofat-UVB组 （紫外线照射+nanofat注射，n＝6）。注射4周后取材，肉眼观察各组裸鼠皮肤质地；HE和Masson染色分别观察裸鼠皮肤结构、真皮层厚度和胶原纤维排列情况；免疫组织化学CD31、Ki-67染色观察皮肤微血管及细胞增殖情况。结果 注射4周后，皮肤大体观发现ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组与PBS-UVB组之间未见明显差异。ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组较PBS-UVB组真皮厚（P＜0.05），且ADSCs-UVB组比Nanofat-UVB组真皮厚（P＜0.05）。ADSCs-UVB组和Nanofat-UVB组均较PBS-UVB组微血管密度高（P＜0.05），ADSCs-UVB组与Nanofat-UVB组间微血管密度无差异（P＞0.05）。ADSCs-UVB组较Nanofat-UVB组表皮细胞增殖多（P＜0.05），在真皮细胞增殖上两组无差异（P＞0.05）。结论 纳米脂肪具有促进真皮中胶原生成、微血管密度增加及表皮细胞增殖的作用。

纳米脂肪 脂肪来源间充质干细胞 光老化 皮肤质地

皮肤光老化（Photoaging Skin）系长期紫外线辐射引起的皮肤老化［1-2］，主要有激光、化学剥脱、肉毒毒素、充填剂及外用抗光老化药物等治疗方法，但效果不一［3-4］。自体脂肪属于活体组织类填充剂，具有来源丰富、易获取、无排斥反应等优点。但是，传统的Coleman脂肪移植法抽取的颗粒脂肪 （Macrofat）直径较大，只能注射到皮下及深部的组织内进行容量充填［5-6］，难以进行表浅皮内注射，限制了其在光老化皮肤治疗中的应用。Tonnard等［7］将1 mm孔径抽脂针抽到的微小颗粒脂肪进行机械乳化，得到含有丰富脂肪干细胞的纳米脂肪（Nanofat），并注射至老化的表浅皱纹的皮内或皮下，4～6个月后观察到注射部位的细纹及肤质均得到明显改善。当前，纳米脂肪对光老化皮肤改善作用的机制尚不明确，缺乏相关的组织学检测。因此，我们将纳米脂肪注射至紫外线诱导的光老化裸鼠皮下，进行纳米脂肪改善裸鼠光老化皮肤质地的实验研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

6 周龄BALB/c裸鼠24只，体质量13～18 g，均为雌性（我院SPF级动物实验中心），饲养1周后进行光老化皮肤模型制备。

脂肪组织均来源于我科接受脂肪抽吸充填术的女性（25～40岁），抽吸部位为腹部、大腿。供者无慢性疾病，并知情同意。

主要设备和器材：1 mm直径侧孔、5 mm直径孔径的抽脂针（金燕医疗器械制造有限公司）；三通管（ABLE公司，美国）；荧光显微镜（Olympus公司，日本）；HE染色试剂盒 （北京雷根生物技术有限公司），Masson染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；CD31抗体 （Santa Cruz，美国）；Kit-67抗体（Santa Cruz，美国）。

1.2 构建裸鼠光老化皮肤模型

6 只裸鼠为空白对照组，另18只裸鼠进行紫外线UVB照射建立光老化动物模型。每周照射5次，共照射8周。第1周每次照射200 sec，即160 mJ/ cm2，第2～4周起每周能量较前一周增加1/3，依次为210 mJ/cm2、280 mJ/cm2、370 mJ/cm2，第5周起维持370 mJ/cm2，至8周时完成建模。继续饲养1周后进行实验动物模型构建。

1.3 ADSCs分离与培养及纳米脂肪制备

1.3.1 脂肪抽取

供脂患者局部注射肿胀液麻醉，10 min后分别用特制的侧孔孔径为1 mm和5 mm的抽脂针连接20 mL注射器，人工负压条件下放射状抽吸，分别得到微小颗粒脂肪和传统的颗粒脂肪。抽吸后注射器直立静置，排净肿胀液后，生理盐水漂洗2遍备用。其中，微小颗粒脂肪用于纳米脂肪制备，颗粒脂肪用于分离培养ADSCs。

1.3.2 ADSCs分离与培养

ADSCs分离及培养方法参照文献［8］。2 d后可观察到ADSCs原代细胞开始贴壁；3 d后换液去掉不贴壁的血细胞及死细胞，6～7 d后待原代长满90%时即可进行传代。实验取第4代细胞重悬于PBS中备用。

1.3.3 纳米脂肪制备

将初步处理后的微小颗粒脂肪经孔径0.5 mm的滤网过滤，随后将脂肪经2个20 mL注射针筒连接三通管快速对打30次，机械乳化，用0.5 mm孔径的滤网再次过滤，得到的脂肪乳化液即为纳米脂肪（图1）。

1.4 实验动物模型的构建

1.4.1 实验分组

①Control组：为空白对照组（n＝6），裸鼠未经任何处理；②PBS-UVB组：UVB照射+PBS注射（自身对照）；③ADSCs-UVB组（n＝6）：UVB照射+ADSCs注射；④Nanofat-UVB实验组 （n＝6）：UVB照射+Nanofat注射。注射后4周取材。

1.4.2 具体注射部位

注射的裸鼠分左右两侧上、下背部共4个注射区域，每个区域为1 cm×1 cm大小。左侧两个区域注射PBS，右侧两个区域注射ADSCs或纳米脂肪。

1.4.3 Nanofat-UVB实验组动物模型制备

①前期我们对1 cm×1 cm大小区域纳米脂肪的注射量进行摸索，参照文献，注射部位皮肤变成黄白色即可。按照这一标准，裸鼠的每一1 cm×1 cm区域的注射量为0.2 mL；②裸鼠腹腔注射水合氯醛麻醉并术前拍照，用标尺测量注射区域。27G针头连接1 mL注射器，经皮下将纳米脂肪注射到裸鼠右侧背部已标记好的上、下两个区域，注射层次尽量表浅，每个区域注射0.2 mL纳米脂肪，进针后边退边推脂肪乳液，确保均匀注射；③裸鼠左侧背部上、下两个区域分别注射0.2 mL PBS作为自身对照组。注射后饲养于SPF级动物房，4周后取材（图2）。

1.4.4 ADSCs-UVB实验对照组动物模型制备

①裸鼠腹腔注射水合氯醛麻醉并术前拍照，用记号笔及标尺测量选取左右、上下背部皮肤进行标记；②第4代ADSCs用PBS重悬成细胞悬液，用27G针头连接1 mL注射器，经皮下分别注射到裸鼠右侧背部两个区域，注射尽量表浅，每个区域注射0.2 mL（含1×106个ADSCs）细胞悬液，进针后边退边推，使细胞悬液在标记区域内均匀平铺；③裸鼠左侧背部上下两个区域分别注射0.2 mL PBS作为自身对照。注射后饲养于SPF级动物房，4周后取材（图2）。

1.5 大体观察

观察各组裸鼠模型注射部位的皮肤变化，包括皮肤质地纹理的变化，取材时同时观察皮下血运及脂肪吸收情况。

1.6 组织学观察

注射后4周取材，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，6 mm厚石蜡切片，HE及Masson染色。根据标准的免疫组化过程，4℃孵育羊抗小鼠CD31抗体过夜，第二天37℃孵育携过氧化氢酶的羊抗小鼠二抗30 min。随后在光镜下DAB显色液显色。同时进行Kit-67免疫组化染色，方法同CD31免疫组化染色。

Masson染色：通过显微镜自带量尺，在100倍视野下，以5个相同间隔距离点测量真皮厚度，计算每张切片平均真皮厚度；CD31染色：分别在200倍光镜下对每张切片随机选取5个视野拍照，计数每张照片中的微血管数量，取平均值为样本的微血管数量；Kit-67染色：分别在400倍光镜下对每张石蜡切片随机选取5个视野拍照，分别计数100个细胞中阳性细胞数（不包括毛囊和皮脂腺增殖的增殖细胞），PI（Proliferate index，PI）=阳性细胞数/细胞总数。

1.7 数据分析

以SPSS软件分析比较各组间平均真皮厚度、微血管数量及PI，均采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 纳米脂肪的制备及大体观Fig.1 Preparation and gross view of nanofat

2 结果

2.1 裸鼠背部皮肤的外观

注射后4周，空白组因自然老化而出现皮肤皱褶。ADSCs-UVB组皮肤质地与PBS-UVB组相比未见差异。Nanofat-UVB组皮肤注射纳米脂肪后即刻，可见皮肤呈黄白色肿胀外观，注射后1周开始淡化，此后每天逐渐吸收淡化，4周后肉眼仍能隐约看到皮下残余脂肪。但是皮肤质地与左侧UVB-PBS自身对照组相比，未见明显差异。

2.2 真皮厚度

空白对照组、PBS-UVB组、ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组真皮厚度分别为 （233.4±5.39）μm、（161.6±3.63）μm、（212.5±9.0）μm和（181.0±6.47）μm。Nanofat-UVB与PBS-UVB对照组，ADSCs-UVB组与PBS-UVB对照组的真皮厚度均有统计学差异（P＜0.05），ADSCs-UVB组与Nanofat-UVB组之间真皮厚度比较有统计学差异（P＜0.05）（图3、5）。

图2 实验动物模型的构建Fig.2 Preparation of experimental animal model

2.3 真皮微血管密度，皮肤细胞增殖

空白对照组、PBS-UVB对照组、ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组每高倍镜下平均微血管密度分别为（16.3±1.14）、（13.0±0.76）、（17.5±1.51）和（16.0± 1.36）。Nanofat-UVB组、ADSCs-UVB组与PBS-UVB组比较，真皮微血管密度均有明显差异 （P＜0.05），ADSCs-UVB组与Nanofat-UVB组间无明显差异（P＞0.05）。空白对照组、PBS-UVB组、ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组每高倍镜下真皮平均增殖指数分别为 （4.15±0.67）、（5.48±1.00）、（5.62±0.82）和（5.77±0.99）。 PBS-UVB组 、ADSCs-UVB组 、Nanofat-UVB组间均无明显差异（P＞0.05）。每高倍镜下表皮平均增殖指数分别为 （41.1±2.44）、（24.4± 2.5）、（37.8±2.0）和 （31.0±1.80），ADSCs-UVB组、Nanofat-UVB组与PBS-UVB组的增殖指数有显著差异 （P＜0.05），ADSCs-UVB组与Nanofat-UVB组之间有显著差异（P＜0.05）（图4、5）。

图3 注射后4周各组皮肤HE染色及Masson染色Fig.3 HE and Masson staining in different groups at 4 weeks after injection

图4 术后4周各组皮肤CD31，Kit-67免疫组化染色Fig.4 CD31 and Kit-67 staining in different groups at 4 weeks after injection

图5 术后4周各组皮肤高倍镜下真皮厚度，微血管数量，表皮细胞增殖指数Fig.5 Dermal thickness，the number of microvessels and the epidermal proliferate index in different groups at 4 weeks after injection

3 讨论

颗粒脂肪移植患者的长期随访发现，脂肪移植部位皮肤皱纹减轻、弹性增加、毛孔缩小及皮肤色泽变均匀，被认为系移植脂肪组织中含有的ADSCs可以分化成不同组织细胞，进而促进组织修复及功能改善［9］。多项创面愈合研究表明，脂肪组织中的ADSCs及其分泌的细胞因子具有促进成纤维细胞增生、增加胶原合成、抗凋亡、抗氧化等作用［10］。有研究发现，光老化的治疗机制与伤口愈合的机制相似，提示了ADSCs具有潜在的抗老化作用。目前已证实ADSCs具有抗皮肤老化的作用。Kim等［11］将ADSCs注射至光老化无毛小鼠皮下，发现ADSCs可促进无毛小鼠老化皮肤的真皮胶原生成、真皮增厚，认为皮下注射ADSCs可作为一种新的治疗皮肤光老化的方法。

Tonnard等［7］对纳米脂肪进行分离培养得到SVFs的细胞数约为等体积的颗粒脂肪的2/3，而SVFs主要干细胞为脂肪来源间充质干细胞，说明纳米脂肪仍然存在大量的脂肪间充质干细胞，且经过CD34+检测及诱导分化，证实这些间充质干细胞的干性完好。高景恒等［12］认为，纳米脂肪是脂肪组织去除白色脂肪细胞后的细胞群，与SVFs是同一性质的细胞群，两者区别在于提取方式不同。尽管纳米脂肪中的细胞数少于SVFs的细胞群，但两者均含有ADSCs，即两者细胞内容是相似的，仅在数量上存在差异。因此，纳米脂肪的应用实际也近似于ADSCs的应用。本实验中，我们将纳米脂肪注射至光老化裸鼠模型皮下，注射后4周后观察到，注射部位真皮增厚，微血管数量增多且表皮细胞增殖明显增多。我们推测纳米脂肪乳液中所含的ADSCs发挥了改善光老化皮肤的作用。

传统颗粒脂肪移植作为结构脂肪移植最大的目的是容量充填作用［9］，而纳米脂肪制备过程中正常脂肪结构被基本破坏，只能作为非结构脂肪移植的形式应用于临床。Kemaloğlu［13］报道了1例左小腿创伤后局部组织缺损的女患者，在接受2次失败的皮肤移植后，第3次进行中厚皮片的移植结合皮下纳米脂肪注射。术后6个月移植皮片完全存活，未见坏死。推测纳米脂肪中存在的干细胞促进成纤维细胞的胶原合成及血管内皮细胞的血管生成，进而促进移植皮片成活。同年，Tamburino等［14］报道了一位患外阴萎缩性硬化性苔藓的女性患者，在阴道口及阴蒂附近的皮内注射20 mL纳米脂肪。10个月随访显示，病灶皮肤质地、大阴唇形态得到了明显的恢复。认为这些改善源于纳米脂肪中干细胞的促皮肤再生能力。通过这些临床应用报道，可以肯定纳米脂肪促进皮肤再生及功能改善的作用，其作用可能与所含ADSCs密切相关。

另外，相对于ADSCs的分离提取培养，纳米脂肪则有这些优势：①获取简单，污染可能性小，可直接应用；②不需要培养扩增，无培养过程中的污染和致瘤风险；③无培养过程中细胞干性丢失的可能，保持其增殖和分化的潜能［15-16］。因此，纳米脂肪相对于ADSCs在临床运用中具有更简便、经济、安全、高效的优点。

综上所述，我们推测纳米脂肪改善光老化皮肤质地是通过其含有的ADSCs促进真皮胶原生成，微血管生成及表皮基底细胞增殖，更具体的机制需要进一步研究。

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The Improvement of Photoaging Skin Texture on Nude Mouse by Nanofat Grafting

HUANG Huizhen，LI Wei，XU Peng，YU Qian，ZHANG Wenjie，LIN Xiaoxi.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LI Wei
（E-mail：liweiboshi@163.com）.

Objection To explore the mechanism of nanofat improving photoaging skin texture of nude mice and to provide related evidence for the clinical application of nanofat on photoaging skin.Methods Eighteen 6-8 weeks female BALB/c nude mice were included and divided into four groups：control group （no intervention，n=6），PBS-UVB group （ultraviolet irradiation+PBS injection），ADSCs-UVB group（ultraviolet irradiation+nanofat injection，n=6），Nanofat-UVB group （ultraviolet irradiation+nanofat injection，n=6）.Four weeks after injection，skin specimens were collected：the skin texture of each group were evaluated by general observation；HE and Masson stain were performed to observe skin structure，dermis thickness and collagen fibers arrangement；immunohistochemistry stain of CD31 and Ki-67 were performed to observe the microvessel density and cell proliferation respectively.Results Four weeks after injection，in terms of skin general observation：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed no obvious difference compared with PBS-UVB group.In terms of dermis thickness：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed obvious thicker dermis than PBS-UVB group （P＜0.05）and ADSCs-UVB group showed thicker dermis than Nanofat-UVB group （P＜0.05）.In terms of dermis microvessel density：ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group showed higher microvessel density than PBS-UVB group （P＜0.05），there was no difference between ADSCs-UVB group and Nanofat-UVB group （P＞0.05）.In terms of cells proliferation：ADSCs-UVB group showed more increased epidermic cells proliferation than Nanofat-UVB group （P＜0.05），the two groups showed no difference of dermis cells proliferation（P＞0.05）.Conclusion Nanofat have the ability to improve dermis collagen generation，microvessel density multiplication and epidermic cells proliferation.

Nanofat；Adipose-derived mesenchymal stem cells；Photoaging；Skin texture

R622

A

1673－0364（2016）04－0212－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.002

国家自然科学基金（81071565）。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李伟（E-mail：liweiboshi@163.com）。

（2016年5月20日；

2016年7月2日）