忧遁草活性物质超声辅助提取工艺的优化

于群，段伟文，刘兵，段振华，，*，商飞飞（.海南大学食品学院，海南海口5708；.贺州学院食品研究院，广西贺州54899）



忧遁草活性物质超声辅助提取工艺的优化

于群1，段伟文2，刘兵1，段振华1，2，*，商飞飞2
（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.贺州学院食品研究院，广西贺州542899）

以多酚、黄酮、三萜和维生素C 4种活性物质为指标，研究超声时间、超声温度、料液比和超声功率对忧遁草中活性物质提取效果的影响，利用正交试验优化超声辅助提取忧遁草活性物质的最佳工艺条件。试验结果表明料液比和超声时间对多酚、黄酮和维生素C得率的影响较大；超声功率和超声时间对三萜得率影响较大。通过四因素三水平的正交试验，确定了忧遁草中4种活性物质提取的最佳条件，得出超声辅助提取的最优提取工艺是：超声时间40 min，超声温度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超声功率156 W。在此条件下4种活性成分的得率分别为：多酚9.387 mg/g，黄酮28.785 mg/g，三萜23.665mg/g，维生素C0.216mg/g。

忧遁草；活性物质；超声波；提取

忧遁草又名鳄嘴花、扭序花等，在海南省五指山等少数民族地区称之为“接骨草”。忧遁草为爵床科鳄嘴花属植物，生长在靠近赤道的低海拔疏林中或灌丛内潮湿砂质土壤里，是一种高大草本植物，它分布于东南亚地区以及我国海南、广东、广西和云南等地［1-2］。忧遁草一般以全株或叶片入药，味甘、微苦，性凉，具有清热利湿、利尿消肿、活血疏经、除湿、抗肿瘤等功效。在泰国民间，忧遁草已被作为一种广泛运用的药用植物，常被用于昆虫或毒蛇咬伤［3］。据文献记载，忧遁草的这些生理活性主要归根于其中含有丰富的三萜类、黄酮糖苷、多酚类和维生素类等活性成分［4-5］。所以将这些活性成分充分高效地提取具有重要意义。超声提取技术操作简单、快捷，提取成本低，而且超声波能显著加速传质过程，提高提取效率［6-8］。本文以多酚、黄酮、三萜和维生素C 4种活性物质为测定指标，利用超声波辅助提取忧遁草中的活性物质，确定最佳工艺，为忧遁草的进一步开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

忧遁草粉末：海南五指山万家宝科技有限公司提供。

没食子酸标准品、芦丁标准品、2，6-二氯靛酚、齐墩果酸和香草醛：上海源叶生物科技有限公司；福林酚标准品，北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸：西陇化工股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器与设备

KS-300E超声波清洗机：宁波科生仪器厂；7200可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；BS124S电子天平：Sartorius公司；HH-S26S电热恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；EL204电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司等。

1.3方法

1.3.1多酚得率的测定方法

标准曲线的绘制：参照徐辉艳等［9］方法，稍作修改。以试剂空白参比，用最小二乘法做线性回归，得多酚浓度（mg/mL）与吸光度A的回归方程为A= 91.406C1+0.015 9，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述标准曲线步骤操作测定吸光度并由上述公式计算得到多酚的质量浓度。

多酚得率/（mg/g）=100C1×V1/m，式中：C1为多酚的质量浓度；V1为待测液体积；m为忧遁草质量。

1.3.2黄酮得率的测定方法

标准曲线的绘制：参照李鹏婧等［10］方法，稍作修改。以试剂空白参比，用最小二乘法做线性回归，得黄酮浓度（mg/mL）与吸光度A的回归方程为A=5.8766C2+ 0.015 9，r2=0.995 5。

量取提取液1 mL，按照上述标准曲线步骤操作测定吸光度并由上述公式计算得到黄酮的质量浓度。

黄酮得率/（mg/g）=100C2×V2/m，式中：C2为黄酮的质量浓度；V2为待测液体积；m为忧遁草质量。

1.3.3三萜得率的测定方法

标准曲线的绘制：参照黄生权等［11］方法，稍作修改。以试剂空白参比，用最小二乘法做线性回归，得三萜浓度（mg/mL）与吸光度A的回归方程为A= 42.899C3－0.016 2，r2=0.995 8。

量取提取液0.5 mL，按照上述标准曲线步骤操作测定吸光度并由上述公式计算得到三萜的质量浓度。

三萜得率/（mg/g）=100C3×V3/m，式中：C3为三萜的质量浓度；V3为待测液体积；m为忧遁草质量。

1.3.4维生素C含量的测定方法

参照赵晓梅等［12］方法，稍作修改，对忧遁草中的维生素C含量进行测定。先对2，6-二氯靛酚进行标定，标定所得滴定度T（mg/mL）的计算公式为：T=CV/（V1-V0），式中：C为标准抗坏血酸浓度；V为吸取的标准抗坏血酸溶液体积；V0为空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液体积；V1为滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液体积。

然后根据公式计算维生素C（mg/100 mg）的提取率：维生素C/（mg/100 mg）=5（V2-V0）T/M，式中：V0为空白溶液滴定所消耗的2，6-二氯靛酚溶液体积；V2为提取液滴定时所消耗的2，6-二氯靛酚溶液体积；T为滴定度；M为测定时吸取的提取液相当于忧遁草原料的质量。

1.3.5提取试验设计

单因素试验：根据预试验结果，选取超声时间（10、20、30、40、50 min）、料液比［1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mg/mL）］、超声温度（30、40、50、60、70℃）和超声功率（72、108、144、180、216 W）4个因素进行单因素试验，在控制其他因素不变的情况下，考察各个单因素对忧遁草多酚、多糖、黄酮和维生素C得率的影响。

正交试验：在单因素试验结果的基础上以超声时间、料液比、超声温度和超声功率为考察因素，设计四因素三水平的正交试验，对超声波辅助提取忧遁草活性物质的工艺进行优化。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1超声时间对活性成分得率影响的结果与分析

准确称取1.00 g忧遁草粉末，设定超声温度为50℃，超声功率为144 W，探索超声时间对忧遁草各活性成分得率的影响。结果如图1所示。

图1　超声时间对得率的影响Fig.1　Effect of ultrasound treatment time on yield

由图1可以看出，随着超声时间的增加各成分得率都呈现增大的趋势，当超声时间增加到30 min时，随着超声时间的增加，维生素C和三萜含量呈明显下降趋势，其他成分变化较平缓。这可能是因为超声时间的延长使已溶出的维生素C被氧化而造成损失；而且超声波独具的物理性质能够促使植物细胞组织破壁或变形，短时间内即可获得最佳得率，但随着时间过长，强烈的空化作用将使分子结构发生改变且超声波处理过程不断产热，对三萜造成一定损失［13］；除此之外，时间过长，一些黄酮和多酚因不稳定而易被氧化，时间过短，部分黄酮和多酚溶解不充分［14］。因此，从节约能源和活性物质得率降低的角度考虑，选定30 min为较适超声时间。

2.1.2料液比对活性成分得率影响的结果与分析

设定超声时间30 min，超声温度为50℃，超声功率比为144 W，探索料液比对忧遁草各活性成分得率的影响。结果如图2所示。

图2　料液比对得率的影响Fig.2　Effect of material/liquid radio on yield

由图2可以看出，随着料液比的增加，多酚、黄酮、维生素C和三萜的得率呈现增大趋势，其中，维生素C、三萜和多酚在料液比为1∶50（mg/mL）时出现最大值，黄酮、三萜和多酚的含量随着料液比的增加而趋于平稳，这可能是因为溶剂量过大时，超声波辐射被溶剂分子吸收较多，溶剂分子分散了超声波对有效成分的作用，作用于物料相对较少，活性物质提取不完全，因而会影响黄酮、三萜和多酚的析出［15］。综上考虑，选择1∶50（mg/mL）为较适料液比。

2.1.3超声温度对活性成分得率影响的结果与分析

准确称取1.00 g忧遁草粉末，设定超声时间为30 min，超声功率为144 W，探索超声温度对忧遁草各活性成分得率的影响。结果如图3所示。

图3　超声温度对得率的影响Fig.3　Effect of ultrasound temperature on yield

由图3可以看出，随着温度的升高，4种活性物质的得率都表现出先增大后减小的趋势，其中黄酮和维生素C在整个过程中变化趋势较明显，多酚和三萜变化趋势较平缓。随着提取温度的上升，活性分子的运动速度加快，而且热量对细胞壁有破坏作用，使其容易从细胞中提取出来，当提取温度达到50℃时，继续增加温度，提取率有所下降，这可能是因为温度过高，活性物质易被氧化，导致得率降低［16］。此外，多酚在较高温度和超声波的作用下还可能发生变质［17］，所以，选择50℃为较佳提取温度。

2.1.4超声功率对活性成分得率影响的结果与分析

准确称取1.00 g忧遁草粉末，设定超声时间为30 min，超声温度为50℃，探索超声功率对忧遁草各活性成分得率的影响。结果如图4所示。

图4　超声功率对得率的影响Fig.4　Effect of ultrasound power on yield

由图4可以看出，随着超声功率的增加，4种活性物质的得率呈现增大的趋势，当超声功率达到144 W时，四种活性物质的功率达到最大值，但随着超声功率的继续增加，活性物质得率下降。这主要是由于超声功率的增加，溶剂分子扩散速度加快，有利于活性物质的浸出；但随着功率的进一步增加，过高的超声功率产生瞬时高温会使许多活性成分遭到破坏，杂质溶出较多，因此它们得率会降低［18］。综上考虑，选择144 W为最佳提取功率。

2.2正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，选取超声时间、超声温度、料液比和超声功率为考察因素，设计四因素三水平的正交试验，因素水平设计表见表1。

表1　正交试验因素水平表Table 1　Factors and their levels in orthogonal array design

试验结果分析如表2所示。

由表2可以看出，多酚得率影响因素的主次顺序为C＞A＞D＞B，A2B1C3D3为最优组合；黄酮得率影响因素的主次顺序为A＞C＞D＞B，A3B2C3D2为最优组合；三萜得率影响因素的主次顺序为D＞A＞C＞B，A2B1C2D3为最优组合；维生素C得率影响因素的主次顺序为A＞C＞D＞B，A1B3C2D3为最优组合。考虑到料液比对多酚的影响最显著，所以选择多酚的最佳料液比1∶55（mg/mL）为最优料液比；超声时间对黄酮的影响最显著，所以选择黄酮的最佳超声时间40 min为最优超声时间；而超声功率对三萜的影响最显著，所以选择三萜的最佳超声功率156 W为最优超声功率；超声温度对4种活性物质的影响并不显著，为保证其最大活性，选择45℃为最优超声温度。综上所述，确定最优组合为A3B1C3D3，即提取时间40 min，超声温度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超声功率156 W。

表2　正交试验结果Table 2　Results of orthogonal test

根据筛选到的最优组合进行3次平行验证试验，试验结果平均值为：多酚得率9.476 mg/g，黄酮得率28.695 mg/g，三萜得率23.719 mg/g，维生素C得率0.216 mg/g均高于或接近正交试验结果。

3　结论

利用超声波技术辅助提取忧遁草内4种活性物质（多酚、黄酮、三萜、维生素C）。并考察4个因素（超声时间、超声温度、料液比和超声功率）对4种活性物质得率的影响。

多酚得率的影响大小因素次序为料液比＞提取时间＞超声功率＞超声温度，黄酮得率的影响大小因素次序为提取时间＞料液比＞超声功率＞超声温度，三萜得率的影响大小因素次序为超声功率＞提取时间＞料液比＞超声温度，维生素C得率的影响大小因素次序为提取时间＞料液比＞超声功率＞超声温度。

超声波辅助提取的最佳条件为：提取时间40 min，超声温度45℃，料液比1∶55（mg/mL），超声功率156 W。

［1］林级田，李惠敏，余竞光.傣药扭序花化学成分的研究［J］.中草药，1983，14（8）:337

［2］刘旭，郭文洁，黄丹民，等.鳄嘴花正丁醇提取物对小鼠Heps肝癌的抑制作用［J］.江苏大学学报（医学版），2014，24（3）:211-215

［3］王贤儿，钟希文，张文霞，等.基于忧遁草化学成分研究分析其抗肿瘤作用［J］.中国药房，2013，24（43）:4104-4107

［4］易博，徐文彤，邓盾，等.鳄嘴花叶氨基酸和微量元素分析及其化学成分研究［J］.解放军药学学报，2012，28（5）:396

［5］Dampawan P，Huntrakul C，Reutrakul V，et al.Constituents of Clinacanthus nutans and the crystal structure of LUP-20（29）-ene-3-one［J］.J Sci Soc Thai，1977（3）:14

［6］刘怡彤，段振华，马华林，等.超声波辅助提取黄秋葵多酚和多糖的工艺研究［J］.食品工业科技，2013，34（21）:247-249，253

［7］段振华，汪菊兰，王美蓉.超声波辅助制备鱼鳔寡肽的研究［J］.中国食物与营养，2008（6）:27-29

［8］Duan Zhen-hua，Li Yan-lan，Wang Ju-lan.Study on the technology of extraction protein of fish swim bladder with ultrasonic treatment［J］.Advanced Materials Research，2012（396/398）:1413-1416

［9］徐辉艳，孙晓东，张佩君，等.红枣汁中总酚含量的福林法测定［J］.食品研究与开发，2009，30（3）:126-128

［10］李鹏婧，柳旭光，龙海荣，等.超声波辅助提取菱角壳总黄酮及抗氧化性研究［J］.食品科技，2011，36（1）:167-171

［11］黄生权，姚松君，刘翠玲，等.不同生长期的灵芝三萜含量测定及变化规律研究［J］.现代食品科技，2011，27（8）:1015-1019

［12］赵晓梅，江英，吴玉鹏.果蔬VC含量测定方法的研究［J］.食品科学，2006，27（3）:197-199

［13］陈莉华，吴玲，李林芝，等.玄参总三萜提取物制备及其抗氧化生物活性研究［J］.林产化学与工业，2013，33（6）:85-90

［14］肖晓莹，庞杰.显齿蛇葡萄黄酮化合物提取及其提取物抗氧化活性研究［D］.福州:福建农林大学2013:18-19

［15］吕明生，王淑军，房耀维，等.超声波提取雪莲薯多糖工艺优化及其对羟自由基的清除［J］.食品科学，2011，32（2）:24-27

［16］李晓军，吴俊林，等.超声波辅助提取金银花黄酮类化合物的研究［D］.西安:陕西师范大学，2009:29

［17］娄在祥，王洪新，陈尚卫，等.牛蒡叶多酚的超声波辅助提取及抗氧化活性、成分分析研究［J］.食品工业科技，2010，31（8）:261-264

［18］韩晓祥，周凌霄，励建荣，等.超声波辅助提取胡柚皮黄酮及抗氧化作用研究［J］.中国食品学报，2011，11（4）:55-61

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process for Active Substance from Clinacanthus nutans

YU Qun1，DUAN Wei-wen2，LIU Bing1，DUAN Zhen-hua1，2，*，SHANG Fei-fei2
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Institue of Food Research，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

With polyphenols，flavonoids，triterpenoid and vitaminC as detection index，the effect of ultrasonic temperature，time，power and solid-liquid ratio on extraction efficiency was studied.Optimum extraction process was determined by orthogonal test.The solid-liquid ratio and ultrasonic time had great effect on extraction efficiency of polyphenols，flavonoids and vitaminC.The ultrasonic power and ultrasonic time had a greater effect on triterpenoid than the temperature and solid-liquid ratio.The best condition of active substance of Clinacanthus nutans was determined by four-factor and three-level orthogonal test.The optimal extraction process conditions were determined as follows：ultrasonic temperature，45℃；ultrasonic power，156W；and solid-liquid ratio，1∶55（mg/mL）for an extraction duration of 40 minutes.Under these conditions the extraction yield of each component were：polyphenols 9.387 mg/g，flavonoids 28.785 mg/g，triterpenoid 23.665 mg/g，vitaminC 0.216 mg/g.

Cinacanthus nutans；active substance；ultrasonic；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.013

于群（1993—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品工程。

段振华（1965—），男（汉），教授，博士，研究方向：水产品食品科学技术。

2015-11-27