纤维素降解菌的筛选及酶学性质的研究

李鑫玲，孙晓菲，李欣（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）



纤维素降解菌的筛选及酶学性质的研究

李鑫玲，孙晓菲，李欣
（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）

从土壤样本中分离得到1株酶活性质较高的菌株，采用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS）进行酶活性测定，测定结果表明该菌株产酶的最适反应温度为50℃；温度在40℃～60℃时，酶有较高的热稳定性；最适反应pH 5.0；pH在4～6时，酶稳定性达到75%以上；Ca2+、Mn2+是酶反应的促进剂，Pb2+、Hg2+为酶反应的抑制剂。

纤维素降解菌；筛选；酶学性质

纤维素是自然界最丰富、来源最广泛的有机物质，是地球上重要的可再生资源［1］。我国植物纤维素资源丰富，但大部分被焚烧、废弃，造成严重的环境污染。大量研究表明，要纤维素被分解或转化成小分子化合物或其他营养物质，纤维素生物降解具有其它方法无法比拟的优点，因此纤维素酶高产菌的筛选和产酶研究具有重要现实意义。本研究对纤维素酶产生菌进行分离，并对其酶学性质进行初步研究，旨在为该菌的应用研究提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品

土样来源：河南科技大学校园圃的草底土、垃圾堆土及腐叶土。

1.1.2培养基

富集培养基［2］、纤维素刚果红分离培养基［3］、液体摇瓶复筛培养基［4］。

1.2方法

1.2.1纤维素降解菌的初筛

将采集的样品经30℃、220 r/min富集培养48 h后，按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行梯度稀释，并涂布于纤维素刚果红筛选培养基上，30℃恒温培养48 h，测量菌落和透明圈直径，以透明圈直径与菌落直径的比值（D/d）、透明圈清晰度为指标进行筛选。挑选出D/d值较大，且生长较快的单菌落作为初筛菌株。

1.2.2纤维素降解菌的复筛

将经过初筛后获得的菌株接种于液体发酵培养基中，30℃、180 r/min下振荡培养5 d。分别测定羧甲基纤维素酶（CMCase）活性和滤纸酶（FPA）活性，以酶活为指标筛选出目的菌株。

1.2.3纤维素酶活测定

1.2.3.1葡萄糖标准曲线

配制质量浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液，按照DNS法［9］绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.3.2粗酶液的制备

取培养一定时间的发酵液10mL，在4℃，6000r/min条件下离心15 min，上清液即为粗酶液。

1.2.3.3酶活性测定

羧甲基纤维素酶（CMCase）活性和滤纸酶（FPA）活性采用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS法）［5］测定。酶活性单位（U）定义为40℃、pH为7的条件下，每分钟转化底物产生1 mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为1 U/mL。

1.2.4酶学特性的初步研究

在250 mL锥形瓶中进行液体发酵，改变某一条件并保持其他发酵条件不变，通过测定CMCase和FPA活性，研究培养温度、热稳定性、最适pH、pH稳定性及金属离子对酶活的影响。

2　结果与分析

2.1纤维素降解菌的初筛

用CMC-Na刚果红分离培养基分离纯化菌种后，通过观察，发现有6株菌产生较明显的透明圈，其编号分别为1、2、3、4、5、6。观察透明圈、测量透明圈大小，透明圈与菌落直径之比见表1。

表1　菌落及透明圈直径Tabel 1　The diameter of colony and transparent circle

由表1可知，编号为1、2、3、5的4个菌株的透明圈直径/菌落直径比值较大，作为初筛菌株。

2.2纤维素降解菌的复筛

2.2.1葡萄糖标准曲线

以光密度（OD540）为纵坐标，葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，见图1。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　Standard curve of glucose concentration

2.2.2复筛结果

复筛结果见图2。

由图2可知，初筛菌株的CMC酶活顺序为3号＞5号＞1号＞2号，FPA酶活顺序为3号＞1号＞2号＞5号，因此选出3号作为复筛菌株。

图2　复筛结果Fig.2　Results of rescreening

2.3酶活性质的研究

2.3.1酶反应的最适温度

温度对酶活力的影响见图3。

图3　温度对酶活力的影响Fig.3　Effect of temperature on cellulase activity

由图3可知，该菌株在50℃时酶活力达到最高峰，然后开始呈下降趋势。故50℃为该酶的最适反应温度。

2.3.2酶反应的热稳定性

不同温度下酶的稳定性见图4。

图4　不同温度下酶的稳定性Fig.4　Effect of temperature on cellulase stability

由图4可知，在40℃～60℃时，3号菌所产酶有较高的稳定性，当温度超过60℃时酶活力下降很快，说明该菌所产纤维素酶属于中温型的酶。

2.3.3酶反应的最适pH

pH对酶活力的影响见图5。

由图5可知，3号菌所产酶的酶活在pH为4～6时酶活性较高，最适反应pH为5.0左右。

图5　pH对酶活力的影响Fig.5　Effect of pH value on cellulase activity

2.3.4不同pH条件下酶的稳定性的研究

将粗酶液置于不同pH（4、5、6、7、8、9）环境中，于50℃保温60 min然后测定其剩余酶活力，见图6。

图6　不同pH下酶的稳定性Fig.6　Effect of pH value on cellulase stability

由图6可知，3号菌所产酶在pH 4～6时活性在75%以上，当pH大于6时，酶稳定性下降很快，所以该酶属于酸性酶。

2.3.5金属离子对酶活性的影响

在粗酶液反应体系中加入1×10-2mol/L的Ca2+、Mn2+、Pb2+、Hg2+、K+、Fe2+，反应30 min后测定3号菌的CMC酶活力，对照组不加金属离子，见图7。

图7　金属离子对CMC酶活力的影响Fig.7　Effect of metal ions on cellulase activity

由图7可知，1×10-2mol/L的Ca2+、Mn2+对3号菌所产酶的CMC酶活力有明显的促进作用，酶活力分别提高了31%和28%，而Pb2+、Hg2+为酶反应的抑制剂，酶活力分别下降了37%和28%。K+、Fe2+对酶活力的作用不是十分明显。

3　结论

本研究经筛选得到1株酶活性质较高的菌株，并对其产酶的酶学性质进行初步研究。通过DNS法测定3号菌株CMC和FPA酶活，确定出该菌株产酶的最适反应温度为50℃；温度在40℃～60℃时，酶有较高的热稳定性；最适反应pH是5.0；pH在4～6时，酶稳定性达到75%以上；Ca2+、Mn2+是酶反应的促进剂，Pb2+、Hg2+为酶反应的抑制剂。

［1］Lynd L R，Paul J W，Vanzyl W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Biology Reviews，2002，66（3）:65-77

［2］陈路劼，刘斌，林白雪，等.降解纤维素嗜热菌的分离及纤维素酶性质分析［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（1）:67-72

［3］高春，孟建宇，冯福应.纤维素降解菌的分离筛选及其酶活研究［J］.畜牧与饲料科学，2008，29（4）:17-20

［4］刘海波，王义强，陈介南，等.一株高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定［J］.生物学杂志，2008，25（3）:16-20，12

［5］Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959，31（3）:426-428

Screening of Cellulose-degrading Bacteria and Studies on Characters of Enzyme Activity

LI Xin-ling，SUN Xiao-fei，LI Xin
（Food and Bioengineering Department，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

From the nature of a strain isolated from soil samples of enzyme activity of high strain，and their enzyme activities were determined by DNS method.The enzyme activity results showed that the strain enzyme optimum temperature of 50℃；temperature in 40℃-60℃，enzymes had higher thermal stability；the optimum reaction pH was 5.0；pH in 4-6，enzyme stability was above 75%；Ca2+，Mn2+was enzyme reaction promoter，Pb2+and Hg2+was enzyme reaction inhibitors.

cellulose-decomposing microorganisms；screening；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.039

李鑫玲（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：畜产品加工及食品质量与安全。

2015-09-25