分光光度法测定毛酸浆果中总黄酮含量的研究

李世燕，闫公昕，朱丹，牛广财，*，魏文毅（.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆6339；.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆6339）



分光光度法测定毛酸浆果中总黄酮含量的研究

李世燕1，闫公昕1，朱丹2，牛广财1，*，魏文毅1
（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆163319）

探讨建立分光光度法测定毛酸浆中的总黄酮含量的方法，通过考察显色剂用量以及加入显色剂后放置时间对毛酸浆总黄酮测定的影响，采用单因素和正交试验优化硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定毛酸浆果中总黄酮的含量。结果表明，毛酸浆中总黄酮含量测定的最佳的条件为：5%NaNO2溶液0.8 mL，混匀放置2 min后，加10%Al（NO3）3溶液0.8 mL，混匀，继续加4%NaOH溶液6 mL，定容混匀后立即在335 nm下测其吸光度。在此条件下，芦丁标准溶液在0～0.002 4 mg/mL范围内与吸光度值间的回归方程y=289.02x+0.008，R2=0.999 5。该测定方法的平均加标回收率为100.83%，稳定性、精密度以及回收率的相对标准偏差（RSD）分别为0.34%，0.29%和2.91%。该方法简便、快速、准确，可以用于毛酸浆果汁中总黄酮含量的测定。

毛酸浆果；总黄酮；分光光度法

毛酸浆（Physalis pubescens L.）别名洋菇娘、黄菇娘等，酸浆属，一年生草本植物，在我国主要产地为内蒙古呼伦贝尔盟和黑龙江省［1］。毛酸浆果实是一种食用与药用为一体的新型特色营养型水果，其果实中含有生物碱类、脂类、黄酮类等营养保健成分［2］，以及维生素、矿物元素、有机酸和18种氨基酸，其中以天冬氨酸和亮氨酸含量最高［3-5］。毛酸浆因其富含丰富功能成分，赋予人们保健作用的魅力，如解除疲劳、消除肌肉疼痛、降低血压、预防动脉硬化和心血管病的发生和保护皮肤等保健作用［6-7］。

现代药理研究发现黄酮类化合物具有光谱的药理作用，大量研究已表明，黄酮类化合物的多种生物活性，在抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等方面有显著效果，其应用范围越来越广而成为天然产物研究的热点［8］。因此毛酸浆中的黄酮含量可作为评价毛酸浆营养保健价值的一个重要指标。目前对检测黄酮类方法的报道很多，虽然元晓梅等作了总结报道［9］，但在毛酸浆的相关研究中鲜见有关总黄酮含量测定方面的相关研究。本研究对硝酸铝-亚硝酸钠比色法进行优化后测定毛酸浆果中的总黄酮含量，旨在建立快速、简便、准确的毛酸浆果总黄酮含量测定方法，为其进一步开发利用以及黄酮的质量控制提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

芦丁标准品：sigma公司出品；毛酸浆：购于黑龙江省大庆市农贸市场；亚硝酸钠（分析纯）：天津市河东区红岩试剂厂；九水合硝酸铝（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、甲醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；水为去离子水。

1.2仪器与设备

UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器；Exploter分析天平：奥豪斯仪器上海有限公司制造。

1.3方法

1.3.1原理

毛酸浆中含有黄酮类化合物，黄酮类化合物母核上某些位置（如3或5位）上的羟基能与金属离子形成络合物，此外在B环上有任何相邻的双羟基时，也会产生络合作用，这些络合物在吸收光谱上会发生明显的变化［10］，而且其质量浓度与吸光度符合朗伯-比尔定律，颜色的深浅与黄酮类化合物的量又呈一定的比例关系的特性，所以直接于最大吸收波长处测定其吸光度值A，然后通过芦丁标准曲线对照，就可以确定总黄酮含量［11］。本实验就是采用这种原理作为毛酸浆中总黄酮定量测定的依据。

1.3.2芦丁标准品溶液的制备

精确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品10 mg置于100 mL的容量瓶中，加适量甲醇溶解后，以甲醇定容至刻度线，充分摇匀，配成0.1 mg/mL的芦丁标准溶液，备用。

1.3.3样品溶液的制备

取100 g毛酸浆果破碎榨汁，将破碎后的毛酸浆原浆离心（4 000 r/min，15 min），得到澄清的毛酸浆果汁样品，备用。

1.3.4最大吸收波长的选择

准确称取芦丁对照品标准溶液和样品溶液各1.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去离子水定容至刻度，混匀，放置15 min［12］，同时制备空白试液。显色完毕后在紫外分光光度计上300 nm～500 nm进行全波长扫描，确定反应体系的最大吸收波长。

1.3.5显色剂用量对总黄酮含量测定的影响

1.3.5.15%NaNO2溶液用量对总黄酮测定的影响

取7份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25mL的容量瓶中，分别加入浓度为5%的NaNO2溶液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去离子水定容至刻度，混匀，放置15 min。以浓度为5%的NaNO2溶液用量为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究浓度为5%的NaNO2溶液用量对样品总黄酮测定的影响。

1.3.5.210%的Al（NO3）3溶液用量对总黄酮测定的影响

取7份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，然后分别加入浓度为10%的Al（NO3）3溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，再加入4%NaOH溶液10 mL，用去离子水定容至刻度，混匀，放置15 min。以10%的Al（NO3）3溶液用量为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究浓度为10%的Al（NO3）3溶液用量对样品总黄酮测定的影响。

1.3.5.34%的NaOH溶液用量对总黄酮测定的影响

取7份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，分别加入浓度为4%的NaOH溶液各2、3、4、5、6、7、8 mL，定容混匀，放置6 min。以浓度为4%的NaOH溶液用量为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究浓度为4%的NaOH溶液用量对样品总黄酮测定的影响。

1.3.6加入显色剂后放置时间对总黄酮含量测定的影响

1.3.6.1加入5%的NaNO2溶液后放置时间对总黄酮测定的影响

取6份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL的容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，分别放置0、2、4、6、8、10 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容摇匀，放置15 min。以加入5%NaNO2溶液后放置时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究加入5%NaNO2溶液后放置时间对样品总黄酮测定的影响。

1.3.6.2加入10%的Al（NO3）3溶液后放置时间对总黄酮测定的影响

取6份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL的容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置4 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，分别放置0、2、4、6、8、10 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容摇匀，放置15 min。以加入5%NaNO2溶液后放置时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究加入10%的Al（NO3）3溶液后放置时间对样品总黄酮测定的影响。

1.3.6.3加入4%的NaOH溶液后放置时间对总黄酮测定的影响

取8份0.1 mL的毛酸浆果汁样品溶液于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置4 min，加10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，放置2 min，加4%NaOH溶液7 mL，定容摇匀，分别放置0、2、4、6、8、10、12、14 min。以加入5%的NaNO2溶液放置时间为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘图，研究加入5% NaNO2溶液后放置时间对样品总黄酮测定的影响。

1.3.7毛酸浆果总黄酮测定的正交试验

根据单因素试验的结果，以10%Al（NO3）3的用量（A），4%NaOH的用量（B），加入5%NaNO2后放置时间（C），加入10%Al（NO3）3后放置时间（D）作为影响因素，以吸光度为测定指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验，因素水平表见表1。

表1　正交试验因素水平表Table 1　Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.8标准曲线及其回归方程的建立

精密移取芦丁标准品0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，按正交试验得出的最优方法显色，以不加芦丁标准液的溶液为空白参比。用紫外-可见分光光度计在355 nm下测定吸光度。每个浓度平行测定3次，取平均值。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.9稳定性试验

取0.1 mL的毛酸浆样品溶液置于25 mL的容量瓶中，按正交试验得出的最优方法显色，分别按0、2、4、6、8、10、12 min时间间隔放置后测定吸光度值A，并用回归方程计算总黄酮含量。

1.3.10精密度试验

取5份0.1 mL的毛酸浆样品溶液于25 mL的容量瓶中，按正交试验得出的最优方法显色后测定吸光度，并用回归方程计算总黄酮含量。

1.3.11加样回收率试验

取6份0.1 mL的毛酸浆样品溶液置于25 mL容量瓶中，每2份1组，共3组。分别精密加对照品母液1.0，2.0，3.0 mL，用30%乙醇稀释到10 mL，按正交试验得出的最优方法显色后测定吸光度。

2　结果与分析

2.1检测波长的确定

芦丁标准品（b）和样品（a）的紫外可见光谱图见图1。

图1　芦丁标准品（b）和样品（a）的紫外可见光谱图Fig.1　Scanning spectra of standard rutin solution（b）and Physalis Pubescens L.sample（a）

由图1可知，芦丁及毛酸浆样品溶液均在355 nm处有最大吸收峰值，故选择355 nm作为检测波长。

2.2显色剂用量对总黄酮含量测定的影响

2.2.15%NaNO2溶液用量对总黄酮测定的影响

硝酸铝-亚硝酸钠显色法中NaNO2的主要作用是还原黄酮，黄酮分子中的酚羟基在NaNO2作用下产生邻二醌结构，5%NaNO2溶液用量对总黄酮测定的影响结果见图2。

图2　5%NaNO2溶液用量对总黄酮测定的影响Fig.2　Effect of 5%NaNO2amount on the total flavonoids

由图2可以看出，随着5%NaNO2溶液用量的增加，吸光度值不断上升，原因可能是NaNO2在还原黄酮的同时也将毛酸浆果汁中的非黄酮类物质还原，该物质在355 nm左右下也有吸收。结合文献，选择5% NaNO2溶液添加量为1.0 mL［11］。

2.2.210%Al（NO3）3溶液用量对总黄酮测定的影响10%Al（NO3）3溶液用量对总黄酮测定的影响结果见图3。

图3　10%A（lNO3）3溶液用量对总黄酮测定的影响Fig.3　Effect of 10%A（lNO3）3amount on the total flavonoids

由图3可知，随着10%Al（NO3）3溶液用量的增加，在0.6 mL～1.0 mL范围内，吸光度值较大，并在1.0 mL左右取得最大值，说明10%Al（NO3）3溶液添加量在1.0 mL时可以与毛酸浆果汁中还原的黄酮类物质完全络合。继续增加10%Al（NO3）3溶液的添加量，黄酮类分子中的酚羟基与Al3+形成的络合物分解，吸光度值下降。基于该实验结果，选择10%Al（NO3）3溶液用量在1.0 mL左右研究其对毛酸浆果汁总黄酮测定的影响，效果较好。

2.2.34%NaOH溶液用量对总黄酮测定的影响

NaOH的主要作用是使黄酮类化合物开环，生成2’-羟基查尔酮而显色，4%NaOH溶液用量对总黄酮测定的影响结果见图4。

图4　4%NaOH溶液用量对总黄酮测定的影响Fig.4　Effect of 4%NaOH amount on the total flavonoids

由图4可知，随着4%NaOH溶液用量的增加，吸光度值逐渐增大。当4%NaOH溶液用量为7 mL时吸光度值最大。说明4%NaOH添加量为7 mL左右时可以较好地显色，所以，选择4%NaOH溶液用量6 mL～8 mL进行后续研究。

2.3不同显色剂放置时间对对总黄酮测定的影响

2.3.1加入NaNO2溶液后不同放置时间对试验结果的影响

加入NaNO2溶液后不同放置时间对总黄酮测定的影响见图5。

图5　加入5%NaNO2溶液后放置时间对总黄酮测定的影响Fig.5　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 5%NaNO2

由图5可知，加入5%NaNO2溶液后放置0 min～10 min，样品吸光度的变化趋势明显。放置时间为4 min时，吸光度值最大，说明在毛酸浆样品的总黄酮含量测定中，NaNO2还原的各种物质的稳定性不同，随着放置时间的进一步增加，吸光度值下降。所以，选择加入5%NaNO2溶液后放置时间为2 min～6 min进行后续研究。

2.3.2加入Al（NO3）3溶液后不同放置时间对试验结果的影响

加入Al（NO3）3溶液后不同放置时间对总黄酮测定的影响见图6。

图6　加入10%的Al（NO3）3溶液后放置时间对总黄酮测定的影响Fig.6　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 10%Al（NO3）3

图6可知，加入10%Al（NO3）3溶液后的时间间隔对试验影响较大，在0～4 min内样品吸光度较高，可能是Al3+与黄酮类化合物形成络合物时间较短。4 min～10 min时样品吸光度逐渐降低，可能是该络合物不稳定。由结果中可以看出2 min时样品吸光度最高，故选择加入10%Al（NO3）3溶液后放置时间为0 min～4 min研究其对毛酸浆果中总黄酮测定的影响。

2.3.3加入NaOH溶液后不同放置时间对实验结果的影响

加入NaOH溶液后不同放置时间对总黄酮测定的影响见图7。

图7　加入4%的NaOH溶液后放置时间对总黄酮测定的影响Fig.7　Effect of reaction time on the total flavonoids after adding 4%NaOH

由图7可知，加入4%NaOH溶液后，样品吸光度比较稳定。可能是黄酮类化合物显色比较稳定，但是整个变化趋势是呈下降趋势。因此，在加入4%NaOH溶液后，尽快测定，以缩短此步骤的时间。

2.4正交试验结果

通过对10%的Al（NO3）3的用量、4%NaOH的用量、加入5%NaNO2后放置时间、加入10%Al（NO3）3后放置时间的L9（34）正交处理，得到9种组合方案，毛酸浆总黄酮测定的正交试验优化结果见表2。

由表2极差结果分析可知，对总黄酮含量测定的影响由大到小依次是：10%Al（NO3）3放置时间＞4%NaOH溶液添加量＞5%NaNO3溶液放置时间＞10% Al（NO3）3溶液添加量。由k值确定毛酸浆果汁中总黄酮含量测定的最佳实验条件为A1B1C1D1，即10% Al（NO3）3溶液添加量为0.8 mL，4%NaOH溶液添加量为6 mL，5%NaNO3溶液放置时间为2 min，10% Al（NO3）3溶液放置时间为0 min。

表2　正交试验L9（34）结果及分析Table 2　Results and analysis of the orthogonal experiment L9（34）

2.5芦丁标准曲线

根据不同浓度的芦丁在最佳条件下测定355 nm处的吸光度值，绘制标准曲线见图8。

图8　硝酸铝法测定的芦丁标准曲线Fig.8　Standard curve of standard rutin solution by Al（NO）33colorimetry

得出线性回归方程为y=289.02x+0.008，R2=0.9995，芦丁标准溶液在0.0000～0.0024 mg/mL范围内与吸光度值间有良好的线性关系。

2.6稳定性试验结果

稳定性考察结果见表3。

分析结果可知，样品溶液的RSD值为0.34%，结果表明该样品在12 min内进行测定稳定性良好。

表3　稳定性试验结果Table 3　Result of stability test

2.7精密度试验结果

精密度考察结果见表4。

表4　精密度试验结果Table 4　Result of precision test

分析结果可知，样品溶液吸光度值的RSD=0.29%，说明精密度良好。

2.8加样回收率试验结果

加样回收率考察结果结果见表5。

表5　加样回收率试验结果Table 5　The result of recovery test

结果表明，6次测定的平均加样回收率为100.83%，RSD=2.91%，说明该测定方法具有良好的回收率。

3　结论

本研究通过正交试验得出硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定毛酸浆果中的总黄酮时，10%Al（NO3）3溶液的添加量、4%NaOH溶液的添加量、加入5%NaNO2溶液后的放置时间、加入10%Al（NO3）3溶液后的放置时间对总黄酮的测定影响明显。得出毛酸浆果中总黄酮测定的的最佳实验条件为：添加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀放置2 min，加10%Al（NO3）3溶液0.8 mL后摇匀，立即加4%NaOH溶液6 mL摇匀显色后立即测定。

此方法测定毛酸浆果中总黄酮时，标准品和样品的光谱最大吸收波长重叠都很好，以该方法得到的线性方程为y=289.02x+0.008，R2=0.999 5，具有良好的线性关系。该方法测得的毛酸浆果中总黄酮含量为0.573 mg/g。此方法测定具有良好的稳定性和精密度，平均回收率为100.83%，相对标准偏差为2.91%，本方法测定毛酸浆果中的总黄酮含量，结果准确，重现性良好，操作简单，可作为毛酸浆果总黄酮含量测定的方法。

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Study on Quantitative Determination of Total Flavonoids in Physalis Pubescens L.by Spectrophotometry

LI Shi-yan1，YAN Gong-xin1，ZHU Dan2，NIU Guang-cai1，*，WEI Wen-yi1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Spectrophotometric determination of total flavonoids from Physalis Pubescens L.was studied.Al（NO）3Spectrophotometry was optimized through the single-factor experiment and orthogonal experiment and the effect of the amount of chromogenic agent，reaction time were analyzed.The optimum experiment condition used to determinate the total flavonoids in Physalis Pubescens L.was obtained as follows：add 0.8 mL NaNO2（5%），two minutes later，add 0.8 mL Al（NO3）3（10%），then add 6 mL NaOH（4%），mixing them immediatelyevery time，andtheabsorbancewasdetectedunder335nm.Underthismethod，thecorrelationequationwasy=289.02x+ 0.008，R2=0.999 5，it showed a very good linear relationship within the range of 0.000 0-0.002 4 mg/mL.And the stability，precision and average recovery rate was 0.34%，0.29%and 2.91%by RSD（relative standard deviation）respectively and average recovery rate was 100.83%.This method is convenient，fast and accurate to determine the total flavonoids in Physalis Pubescens L..

Physalis Pubescens L.；total flavonoids；spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.031

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2015-Y49）

李世燕（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：果蔬精深加工。

牛广财（1971—），男（汉），教授，博士，从事食品加工与贮藏方面的研究。

2015-05-17