酸解增敏同步荧光测动物食品中头孢拉定残留

李月秋，徐璐璐，吴锦涛，韩媛媛，邸科前，李军（.河北大学综合实验中心医学综合实验中心，河北保定07000；.河北大学预防医学与卫生事业管理系，河北保定07000）



酸解增敏同步荧光测动物食品中头孢拉定残留

李月秋1，徐璐璐2，吴锦涛2，韩媛媛1，邸科前1，李军1
（1.河北大学综合实验中心医学综合实验中心，河北保定071000；2.河北大学预防医学与卫生事业管理系，河北保定071000）

基于头孢拉定酸性降解产物荧光强度更强，吐温-20能提高降解产物荧光强度，建立测定动物性食品中头孢拉定残留量的同步荧光分光光度法。对降解介质及波长差进行了选择，讨论加热时长、硫酸体积、pH值、表面活性剂种类及用量对降解产物荧光强度的影响。结果：选择1.5 mL 2.0 mol/L硫酸溶液，加热120 min，用Na2CO3-NaHCO3缓冲液调pH值到10.6，加入1 mL 5%吐温-20溶液，在1 cm荧光比色皿中，于发射波长λem420 nm～550 nm内，△λ为90 nm条件下扫描测定，468 nm处读出荧光强度。应用加入乙腈沉淀蛋白的方法对动物性食品进行前处理。在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范围内，头孢拉定浓度与降解产物荧光强度呈良好线性关系，相关系数为0.999 2，检出限为2.17 ng/mL。加标水平在0.4μg/mL～0.6μg/mL范围内，回收率为93.91%～96.90%，RSD为0.50%～0.90%（n=3）。建立的新方法可用于动物性食品中头孢拉定残留量检测。

头孢拉定；酸性降解；吐温-20增敏；动物性食品；同步荧光分光光度法

我国政府已将食品安全问题上升到了与社会稳定相关的高度，我国应加大力度解决动物性食品中兽用抗菌药残留超标，生鲜乳违禁物质滥用，蔬菜、水果、茶叶中禁限用高毒农药残留超标等突出问题，并应针对这些问题着手建立食品安全保障体系。此体系中，对动物性食品中兽药残留进行快速、准确检测无疑是一个关键环节。

头孢拉定是第一代头孢烯类β-内酰胺抗生素。临床主要用于呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等感染。因其具有良好抗菌作用，被广泛应用于畜禽疾病治疗预防中。由于其具有肾毒性和容易引起胃肠功能紊乱，在动物性食品中残留会影响人类身体健康。

目前，我国对头孢拉定测定方法很多：中国药典测定头孢拉定［1］含量的方法为高效液相色谱法（HPLC），同时该法也是现阶段最为常见的检测方法之一，主要用于胶囊［2］、药物［3］、血液［4］、尿液［5］、牛奶［5］等样品检测。该方法检测灵敏度高、自动化程度高、结果重现性好；但需使用大量有机溶剂，检测成本高，且易造成环境污染；前处理过程复杂，不利于快速检测；对检测人员要求较高，不易推广。

其他方法还有电化学分析法［6］，流动注射化学发光法［7-8］，紫外分光光度法［9-10］，毛细管电泳法［11-12］，质谱联用［13-14］，荧光分光光度法［15-17］等。电化学分析法应用不是十分普遍，流动注射化学发光法存在着选择性差的问题，紫外法检测灵敏度低，毛细管电泳应用于痕量分析时需要通过一定的技术手段进行富集以提高灵敏度。质谱联用虽然灵敏度高，选择性好，但是不便普及。

荧光法具有便于普及，选择性好，灵敏度高，新技术多等优点。目前主要用于药物中头孢拉定含量测定。何文亮［17］等研究了头孢拉定碱性降解反应，建立了表面活性剂增敏荧光分光光度法测定牛奶中头孢拉定含量。同步荧光光谱法是荧光光谱分析新技术之一，应用最多的是最早提出的恒波长同步荧光法，具有谱带窄化，光谱重叠少，散射光影响小等优点，有利于进一步提高检测灵敏度，减少共存组分干扰。

目前，国内外鲜见头孢拉定酸性降解后，表面活性剂增敏同步荧光法检测动物性食品中头孢拉定残留量的报道。本研究将以探讨头孢拉定酸性降解反应为开端，过程中应用表面活性剂对其进行增敏，最后采用同步荧光法对动物性食品中头孢拉定残留量进行测定，以达到进一步提高检测灵敏度，建立一种便于日常跟踪监测的方法的目的。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

RF-5301PC型荧光分光光度计、AUW120D电子天平：日本岛津；FE20型酸度计：瑞士梅特勒；Milli-Q Advantage A10超纯化水机：法国密理博；TGL-20B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SK-1型快速混匀器：常州国华电器有限公司。

1.0mg/mL头孢拉定标准溶液：称取头孢拉定标准对照品（中国药品生物制品检定所）0.1 g溶于水中，定容至100 mL棕色容量瓶中，并置于冰箱中避光冷藏保存。

硫酸，氢氧化钠，醋酸，醋酸钠，十二烷基硫酸钠（SDS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），十六烷基三甲基氯化铵（CTAC），吐温-20，吐温-80，三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸，磷酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钠，碳酸氢钠等试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2方法

1.2.1样品预处理

1.2.1.1牛奶样品前处理

取5 mL牛奶样品于10 mL离心管中，加入3 mL乙腈快速涡旋混匀10 min，在5 000 r/min条件下离心30 min，吸取上清液作为待测样品。

1.2.1.2猪肉样品前处理

将市售猪肉切碎匀浆，取5 g置于10 mL的离心管中，加入3 mL乙腈快速涡旋混匀10 min，于8 000 r/min条件下离心60 min，取出上清液作为待测样品。

1.2.1.3虾样品前处理

市售虾处理方法同市售猪肉。

1.2.2样品测定

3种样品分别取1.0 mL置于编号1、2、3的3只具塞比色管中，在各管中依次加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液，加水定容至5 mL，沸水浴中加热120 min后取出，用冰水迅速冷却至室温，然后加入2.0 mol/L NaOH溶液调节pH值至中性，然后加入Na2CO3-NaHCO3缓冲液调pH值到10.6，加入1 mL 5%的吐温-20溶液，加水定容至10 mL，涡旋混匀1 min，避光放置2 min，将样品溶液分别置于1 cm荧光比色皿中，在发射波长λem420 nm～550 nm范围内，发射波长和激发波长的波长差为90 nm（△λ=90 nm）条件下分别扫描样品，在468 nm处读出荧光强度。

1.2.3标准曲线和检出限

配置一系列不同浓度的头孢拉定标准溶液，按照1.2.2的实验条件测定，以头孢拉定的浓度为横坐标，降解产物的荧光强度为纵坐标，作图得到标准曲线。标准曲线回归方程为Y=450.83X+14.19（r=0.999 2）。结果表明：在0.02 μg/mL～2 μg/mL范围内，头孢拉定浓度与降解产物荧光强度呈良好线性关系。

根据IUPAC（3δ）［18］的规定，由公式：D=3×δ/k（D为检出限，k为工作曲线斜率，δ为11份空白溶液荧光强度标准差），求得检测限为2.17 ng/mL。

1.2.4精密度和回收率

取市售牛奶9份，每份5 mL，按其浓度的80%，100%，120%，分别加入头孢拉定对照品各3份，按照1.2.1.1的样品前处理方法并按照1.2.2的样品测定方法，测定平均回收率和精密度。

1.2.5稳定性

将按照1.2.2方法处理好的标准品溶液在避光条件下，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h内进行测定，样品荧光强度的RSD为0.7%。结果表明，头孢拉定酸解产物在24 h内稳定性良好。

2　结果与讨论

2.1同步荧光分光光度法条件选择

2.1.1降解介质选择

研究了头孢拉定在不同降解介质中的荧光强度。结果见表1。

表1　不同介质降解产物的荧光强度Table 1　Fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in different degradation medium

试验证明：头孢拉定在水介质中只有少量的荧光物质产生，在酸性和碱性介质中荧光强度都明显增强，酸性介质中降解产物的荧光强度明显高于碱性介质中降解产物的荧光强度。

2.1.2波长差（△λ）选择

按照试验方法，在波长差△λ分别为40、50、60、70、80、90、100、110、120 nm的条件下测定头孢拉定酸解产物的荧光强度。荧光扫描和同步荧光扫描光谱图见图1，同步扫描峰形变窄，有利于减少干扰，且灵敏度有所提高。

由测定结果可知，随着波长差的△λ的增加，头孢拉定酸解产物的荧光强度呈先增长后降低的趋势，当△λ=90 nm时，荧光强度达到最大值。所以选用△λ= 90 nm进行后续研究。

图1　荧光与同步荧光光谱图Fig.1　Fluorescence and synchronous fluorescence spectrum

2.1.3加热时长对荧光强度影响

取头孢拉定标准溶液置于具塞比色管中，依照已建立的实验方法，考察不同加热时间（30、45、60、90、120、135、150 min）下降解产物的荧光强度。结果表明：反应时间越长，降解产物的荧光强度越大；当反应时间大于120 min时，头孢拉定的酸解产物的荧光强度趋于稳定，可认为头孢拉定已酸解完全。所以综合考虑，沸水浴加热时间选择120 min。

2.1.4硫酸体积对荧光强度影响

取头孢拉定标准溶液置于具塞比色管中，依照已建立的实验方法，考察2 mol/L硫酸体积（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL）对降解产物荧光强度的影响。结果表明：随硫酸溶液用量增加，体系的荧光强度不断增强，当硫酸溶液的加入量超过1.5 mL时体系的荧光强度增加趋于平缓，所以实验选择加入1.5 mL 2.0 mol/L的硫酸溶液。

2.1.5pH对荧光强度影响

按照已建立的方法，考察了醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.0）、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（pH5.8、7.0、8.0），Tris-盐酸缓冲液（pH 7.10、8.00、8.90），碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10.14、10.53）对降解产物荧光强度的影响见图2。

图2　pH值对头孢拉定酸解产物荧光强度影响Fig.2　Effect of pH on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

结果如图2所示，随着所用缓冲液pH值增大荧光强度有增大的趋势，当pH值为10.60时荧光强度最大；当pH值超过10.60时，荧光强度随pH值增大而减小。因此，试验选择加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液将pH值调到10.60。

2.1.6表面活性剂对荧光强度影响

应用表面活性剂可将被测分子包裹于胶束内，使其避免因碰撞而发生无辐射去激，从而可提高荧光物质的荧光强度，因此，向反应产物中加入表面活性剂以提高其灵敏度。试验中考察了不同表面活性剂（SDS、CTAB、CTAC、吐温-80、吐温-20）对头孢拉定降解产物荧光强度（F）的影响，见图3～图4。

图3　未增敏及吐温-20增敏的头孢拉定酸解产物同步荧光光谱图Fig.3　Synchronous fluorescence Spectrum of cephradine’s degradation product in acid medium added Twain-20 and not

图4　表面活性剂对头孢拉定酸解产物荧光强度影响Fig.4　Effect of surfactant on fluorescence intensities of cephradine’s degradation product in acid medium

结果表明：向反应体系中加入表面活性剂可使荧光强度明显增大；试验中发现吐温-20对头孢拉定降解产物的荧光强度的提高最为明显。故选择吐温-20作为体系的增敏剂。

2.1.7吐温-20体积分数对荧光强度影响

表面活性剂对荧光强度的增强作用与表面活性剂的浓度有关。因此，考察了体积分数分别为0.5%、2.5%、5%、7.5%、10%时吐温-20对头孢拉定降解产物的增敏效果。结果显示：当吐温-20体积分数为5%时，头孢拉定酸解体系的荧光强度达到最大值。所以试验选用吐温-20溶液的浓度为5%。

2.2样品测定

2.2.1样品前处理条件选择

取牛奶样品适量，分别向其中加入乙腈，分别在3 000、5 000、6 000、7000 r/min的转速下离心各15、30、45、60 min。结果表明：转速5 000 r/min时离心30 min，牛奶中含有的蛋白等杂质已基本沉淀完全，不会干扰测定。

对猪肉及虾样分别进行了如上讨论，结果表明：在转速8 000 r/min时离心60 min，猪肉及虾蛋白等杂质已基本沉淀完全，不会干扰测定。

2.2.2精密度和回收率

按照1.2.4节中精密度和回收率的测定方法，平均回收率及精密度的结果见表2。

表2　平均回收率及相对标准偏差（n=3）Table 2　Determination results of average recovery and RDS（n=3）

2.2.3测定结果

按照1.2.1节中的样品前处理方法对样品进行前处理，按照1.2.2实验条件对样品进行测定，结果如表3。

表3　样品测定结果Table 3　Determination results of samples

3　结论

本研究探索建立了酸解吐温-20增敏动物性食品中头孢拉定残留量的同步荧光检测方法。应用硫酸酸解，加入吐温增敏，在△λ为90 nm条件下同步扫描测定条件下，头孢拉定在0.02 μg/mL～2.00 μg/mL范围内，其浓度与降解产物荧光强度呈良好线性关系，相关系数为0.999 2，检出限为2.17 ng/mL。加标水平在0.4 μg/mL～0.6 μg/mL范围内，回收率为93.91%～96.90%。本文建立的方法选择性好、精密度高、稳定性好、仪器设备简单；与已报道的研究相比［17］，灵敏度有了明显提高。该方法可为动物性食品中头孢拉定药物残留检测提供新方法，也能为食品中药物残留检测研究提供新思路。

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Synchronous Fluorimetric Determination of Residue Cephradine by Acidly Degraded and Sensitized in Animal Food

LI Yue-qiu1，XU Lu-lu2，WU Jin-tao2，HAN Yuan-yuan1，DI Ke-qian1，LI Jun1
（1.Center of Medical Comprehensive Experimental，Center of Comprehensive Experimental，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China；2.Preventive Medicine and Health Management，Hebei
University，Baoding 071000，Hebei，China）

A new synchronous fluorescence spectrophotometry method was developed for the determination of trace cephradine in animal food.The method was based on the condition that Cephradine was degradated in acidic condition and fluorescence intensity of its degradation product was increased by Twain-20.The degradation condition and wavelength difference（△λ）were selected.The effects of heating time，the volume of sulfuric acid，pH，the effect of type and amount of surface active agent on the fluorescence intensity of degradation product were discussed.The results showed：1.5 mL 2.0 mol/L sulfuric acid was selected，heating time was 120 min，the buffer of Na2CO3-NaHCO3was used to increasing pH to 10.6，1 mL 5%Twain-20 solution was added.The standard and sample solution were putted into 1cm fluorescence cuvette，Synchronous fluorescence spectrums were scaned from 420 nm to 550 nm，△λ was 90，the fluorescence intensities were readed at 468 nm. The protein in food sample were precipitaded by acetonitrile.In the range of 0.02 μg/mL-2.00 μg/mL，the concentration of cephradine and the fluorescence intensity of its degradation product had good linearity，the correlation coefficients was 0.999 2，the detection limit was 2.71 ng/mL.At spiked levels of 0.40 μg/mL to 0.60 μg/mL，the recoveries were 93.91%to 96.90%，the relative standard deviation was 0.50%to 0.90%（n=3）.The new method could be used for residue cephradine in animal food.

cephradine；acid degradation；Twain-20 sensitization；animal food；synchronous fluorescence spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.029

河北省省级科技计划自筹经费项目（15275511）

李月秋（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品有害污染物残留分析。

2015-06-17