酒精饮料的总皂苷纯化和定量方法研究

李平凡，王文文，赵鑫，李静，姚勇芳，邓毛程（广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300）



酒精饮料的总皂苷纯化和定量方法研究

李平凡，王文文，赵鑫，李静，姚勇芳，邓毛程*
（广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300）

采用固相萃取小柱提纯酒精饮料样品中的总皂苷，并采用内标法和比色法相结合的方法进行定量检测。提纯方法具有操作步骤简单，且过程中损失量少的优点；将其用于酒精饮料中总皂苷含量的检测可提高该检测方法的灵敏度和重复性，使该检测方法的适用范围更广；本研究结果表明，酒精饮料样品经HC-C18、HLB固相萃取小柱的纯化处理，总皂苷（以三七皂苷R1计）得率达到95%～96%。此外，该检测方法使用内标，可将样品纯化过程的损失计算在内，从而提高了检测方法的精确度，精确度达到总皂苷RSD1.7%；稳定性测定RSD达到1.46%；重复性测定RSD达到1.04%；平均回收率测定为93.85%，RSD为1.65%。

总皂苷；固相萃取小柱；纯化；定量；酒精饮料

皂苷是一类由甾体或是三萜类化合物作为苷元与糖分子缩合而成的低聚糖苷，在自然界分布很广，是很多中草药中的主要活性成分。在保健食品、保健中药和药食两用的食材中，总皂苷被认为是以多味中药为主原料的保健品中的主要功效成分，具有保护心血管、提高记忆力、抗疲劳、改善机体免疫力、抗菌等有价值的生物活性。因此对酒类食品基质中总皂苷含量的质量控制有重要意义。

关于总皂苷的纯化和测定方法有很多研究报道。采用大孔吸附树脂法，是目前提取分离纯化总皂苷的普遍方法。徐媛等采用Amberlite XAD-2大孔树脂纯化保健酒样品，以期去除一定的杂质，提高酒类样品中总皂苷的含量［1］。同样江长源等也使用XAD-2大孔树脂对传统保健酒中的总皂苷进行纯化［2］。利用传统的溶剂萃取也是提纯总皂苷的常用方法。任小虎等采用无水乙醇和正丁醇反复沉淀，对保健酒类样品中的总皂苷进行提取分离［3］；李兆明等采用正丁醇结合超声波提取，反复沉淀提纯保健酒中人参总皂苷，通过比色法测定含量［4］。传统采用大孔树脂纯化样品后，直接使用比色法测定总皂苷含量。不同的前处理方法对保健食品中总皂苷含量的测定有明显的影响。本研究选用不同的大孔树脂处理，结合比色法测定含量，对不同前处理对总皂苷的回收率进行比较，得出D-101和D-941联用对总皂苷的纯化效果最好［5］。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

三七皂苷R1和人参皂苷Re（HPLC级，＞97%）：上海纯优生物科技有限公司；HC-C18固相萃取小柱、HLB固相萃取柱、聚酰胺（PA）小柱、GCB/NH2（碳黑/氨基）小柱、Si硅胶小柱：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等：上海国药集团；去离子水（自制）；酒精饮料：市售（下称饮料）。

SHIMADZU UV-2550紫外分光光度计、分析天平、Agilent 1260高效液相色谱仪、HWS12型水浴锅：上海一恒科技有限公司。

1.2方法

1.2.1固相萃取柱子选择

1.2.1.1固相萃取柱子预处理

固相萃取小柱HC-C18、HLB、聚酰胺PA、GCB/ NH2、Si硅胶小柱，先用2-3BV的甲醇活化，再用2-3BV的蒸馏水冲洗，备用。

1.2.1.2样品纯化

将稀释好的样品溶液2 mL（内含100 μL的三七皂苷R1溶液），加入已预处理好的5种小柱，先用4 mL的蒸馏水冲洗，去除杂质，再分别用2 mL的100%甲醇将皂苷洗脱，收集洗脱液。待HPLC检测。

1.2.1.3高效液相色谱检测

将1.2.1.2中得到的洗脱液，过0.45 μm的滤膜，待HPLC检测。高效液相色谱检测条件：流动相分别为A相：纯水，B相：乙腈，色谱纯；梯度洗脱条件（体积比）：0 min～20 min：15%～40%B相；流速1 mL/min；C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱温：20℃～40℃；检测波长：203 nm。

加入内标三七皂苷R1的样品溶液（已经过柱子纯化），在HPLC检测下，得到内标的峰面积A1；同样条件下，HPLC检测同样浓度的三七皂苷R1溶液，得到峰面积A2。按照峰面积比，计算内标得率。

1.2.2比色法测定总皂苷含量

精确吸取1.2.1.2制备的皂苷纯化液200 μL于具塞试管中，在60℃水浴蒸干，加入0.2 mL，5%香草醛-冰乙酸溶液，混匀；再加入0.8 mL高氯酸，摇匀，在60℃水浴加热15 min，取出后迅速冰浴冷却5 min，加入5 mL冰乙酸稀释，混匀，静置2 min。以不加样品溶液为空白，在400 nm～700 nm处扫描，确定最大吸收波长。在最大吸收波长下，测定吸光度值。

精确吸取200 μL的0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的人参皂苷溶液于具塞玻璃试管中，在60℃水浴挥干，按照比色法显色后，在545 nm处测定吸光度值，建立标准曲线。

2　结果与讨论

2.1固相萃取柱子纯化效果比较分析

饮料加入三七皂苷R1内标后，经过各种柱子的纯化后，进行HPLC检测，获得三七皂苷R1的峰面积，并计算得率。经过对饮料的HPLC检测最后得到总皂苷得率，如图1所示。

图1　总皂苷得率（以三七皂苷R1计）Fig.1　The rate of total saponins（three seven saponins R1）

经过HC-C18、HLB柱子纯化，得率为95%～96%。经GCB/NH2柱、PA聚酰胺柱、Si凝胶柱纯化，三七皂苷R1得率分别为70%、60%、40%。因此HC-C18和HLB显著优于其他3种固相萃取小柱（P＜0.05）。最后确定HC-C18固相萃取小柱纯化、制备饮料中的皂苷，内标得率为96%。

2.2总皂苷测定

精确吸取200 μL的系列人参皂苷Re溶液于具塞玻璃试管中，在60℃水浴挥干，按照1.2.2显色后，在545 nm处测定吸光度值。以浓度和吸光度值拟合，得到人参皂苷标准曲线图，见图2。

图2　人参皂苷标准曲线Fig.2　Ginseng saponin standard curve

得出回归方程为：y=0.608x-0.003 2，R2=0.999 4。说明皂苷含量在0～1.4 mg/mL范围内线性相关性良好。按照上述方法，测定市售饮料中总皂苷的含量为（0.22±0.02）mg/mL。

2.3方法学验证

2.3.1精密度

同一样品溶液6份（按照1.2.1.2处理），依1.2.2显色后，连续测定吸光度值，结果见表1。

表1　精密度试验吸光度值Table 1　Absorbance value of precision test

总皂苷RSD值为1.70%（n=6），表明精密度良好。

2.3.2稳定性

精密吸取样品溶液200 μL，依1.2.2显色后放置，每隔10 min测定一次吸光度值，结果见表2。

表2　稳定性试验吸光度值Table 2　Stability test absorbance value

RSD（相对标准偏差）为1.46%，表明在70 min内较稳定。

2.3.3重复性

样品溶液6份，按照1.2.1.2处理，依1.2.2显色后，测定吸光度值，结果见表3。

表3　重复性试验吸光度值Table 3　Repeatability test absorbance value

RSD为1.07%，表明重复性较好。

2.3.4回收率

精确量取不同量的人参皂苷Re对照品，加入已知含量的样品中，显色后，测定吸光度值，并计算其回收率。结果见表4。

表4　加样回收率试验结果Table 4　Experiment results of sample recovery

平均回收率为93.85%，RSD为1.65%，试验表明本法回收率较高，方法可行。

3　结论

本研究结果表明，饮料样品经HC-C18、HLB固相萃取小柱的纯化处理，总皂苷（以三七皂苷R1计）得率较好。本试验的HLB结果与文献报道［6］相似，茅向军等采用不同填料（Waters Oasis HLB柱，ODS小柱，Strata小柱）的固相萃取小柱，对血浆中人参皂苷Re进行纯化处理，结果表明HLB柱有较好的处理效果。本研究最终选择了C18（HC-C18）固相萃取小柱，作为饮料中总皂苷的提纯方法，采用内标法和比色法相结合的方法进行检测，具有操作步骤简单，且过程中损失量少的优点。从方法学方面，验证了本方法对于饮料总皂苷含量检测具有重现性好、精密度高、稳定性好和回收率高等优点。

［1］徐媛，白少伟，庞文生，等.保健酒中总皂苷含量测定方法研究［J］.药物研究，2014（6）:30-31

［2］江长源，王勤，黄玮岚，等.传统保健酒中功效成分的检测和稳定性研究［J］.酿酒科技，2008（3）:78-80

［3］任小虎，饶铖乐，史路路，等.保健酒中人参皂苷含量的测定［J］.酿酒，2012，39（3）:65-67

［4］李兆明，姬涛，侯林，等.比色法测定保健酒中人参总皂苷含量［J］.吉林中医药，2009，29（5）:425-426

［5］彭维，李双祁，欧爱芬，等.不同前处理方法对保健食品中总皂苷含量测定的影响［J］.食品研究与开发，2014（8）:90-93

［6］茅向军，章晨峰，孙棣，等.不同填料的固相小柱对人参皂苷Re血浆样品萃取回收率的研究［J］.中国中药杂志，2005，30（19）:1516-1518

Study on the Quantitative and Purification Method of Total Saponins in Alcoholic Beverage

LI Ping-fan，WANG Wen-wen，ZHAO Xin，LI Jing，YAO Yong-fang，DENG Mao-cheng*
（Department of Food and Biological Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China）

Purification of total saponins in beverage samples by solid phase exctraction column，and the internal standard method and colorimetric method of combining the quantitative detection.The purification method had the advantages of simple operation steps，and less loss in the process.The content of total saponins in beverages for detection can improve the sensitivity of the detection methodand the repeatability，the scope of application of the method to detect a wider.This study results showed that the samples of alcoholic beverages by HC-C18，HLB solid-phase extraction column purification processing，total saponins（notoginseng saponin R1）yield of 95%-96%.In addition，the detection method using internal standard，could be calculated and purification process of sample loss，so as to improve the detection accuracy.Accuracy total saponins RSD 1.7%；determination of stability of RSD of 1.46%；determination of repeatability RSD of 1.04%.The average recovery was 93.85%，RSD was 1.65%.

total saponin；solid phase extraction；purification；quantification；alcoholic beverage

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.027

创新强校工程专项资金项目（2Q10905）；创新强校工程专项资金项目（1A20201）；创新强校工程专项资金项目（1A10205）；广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103）；创新强校工程专项资金项目（2A20301）；创新强校工程专项资金项目（1A20105）

李平凡（1973—），男（汉），教授，硕士，从事食品生物技术教学与科研。

邓毛程（1971—），男（汉），教授，博士，从事食品生物技术教学与科研。

2015-06-24