β-乳球蛋白结构稳定性的光谱研究*

贾　慧，王志清，魏　晶，董又铭，于志月, 李慧卿

(忻州师范学院化学系，山西　忻州　034000)



科学实验

β-乳球蛋白结构稳定性的光谱研究*

贾慧，王志清，魏晶，董又铭，于志月, 李慧卿

(忻州师范学院化学系，山西忻州034000)

在pH=7的缓冲溶液及室温条件下，通过盐酸胍、尿素对β-乳球蛋白的结构稳定性进行了研究。β-乳球蛋白在盐酸胍溶液中的Cm为2.3 mol·L-1、结构稳定化能为14.051 kJ/(mol·L-1)。β-乳球蛋白可以结合与结合N-苯基-1-萘胺，结合该配体使蛋白在盐酸胍中的结构稳定化能提高到17.443 kJ/(mol·L-1)。在尿素溶液中结合N-苯基-1-萘胺后的β-乳球蛋白，其稳定化能也从14.250 kJ/(mol·L-1) 提高到17.736 kJ/(mol·L-1)，与蛋白在盐酸胍溶液中的变化趋于一致。

N-苯基-1-萘胺；β-乳球蛋白；荧光光谱

β-乳球蛋白(β-LG)，它是一种分子量约18.4 kD的球形蛋白，由162个氨基酸残基组成，单体由8条反平行的β带组成的β桶装结构。它是乳清蛋白的主要组成部分，具有较强的结合脂溶性维生素、脂肪酸的能力及提高这些小分子在机体中的转运效率； 在机体内清除维生素A代谢物所形成的色素沉淀，抑制酪氨酸酶活性的能力；在体内VE缺乏的情况下，它还能够显著增加肝脏中的还原型谷胱甘肽，有效提高细胞膜的抗氧化能力[1-3]。由于这些丰富的生物功能，使得其在化妆业、保健食品及医药等相关领域有着巨大的应用前途。而所有这些性质和功能是建立在β-乳球蛋白的结构基础上的，因而对其构象变化及结构稳定性的研究也一直是热点。

本文通过光谱手段测定了β-乳球蛋白在尿素、盐酸胍中遭受的构象变化，并通过比较不同浓度下空蛋白和结合配体N-苯基-1-萘胺后蛋白的吉布斯自由能，获得了二者的稳定化能。

1　实验部分

1.1试剂和仪器

N-苯基-1-萘胺，β-乳球蛋白(生物试剂)，美国 Sigma公

司；其他试剂均为分析纯，购于天津市光复精细化工研究所，实验用水均为二次蒸馏水。

F-4500荧光光度计，日本日立公司；UV-2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2光谱测定

荧光发射光谱实验：在室温下，使用1 cm荧光池，用F-4500荧光光度计测定，激发和发射狭缝宽度均为固定值10 nm。荧光发射光谱测定中激发波长Ex=280 nm,扫描范围300～600 nm。

2　结果与讨论

2.1盐酸胍对β-LG构象的影响

色氨酸残基的荧光对环境的变化非常敏感，常常作为蛋白质构象变化的指针。色氨酸荧光光谱的红移通常被认为是微环境极性增加的结果。通常认为色氨酸处于疏水环境时最大发射波长λmax=331 nm，部分暴露于水中时λmax=341 nm，完全暴露于水中 时λmax=351 nm[4]。

图1　盐酸胍对β-LG最大发射峰位的影响(CLG=1×10-6 mol·L-1)

由图1可以看出，在没有出现盐酸胍时，β-LG的色氨酸残基荧光发射在332 nm附近，表明色氨酸残基主要表现为埋在蛋白内部；随着盐酸胍浓度的增加，其波长逐渐红移。当盐酸胍浓度在2.3 mol·L-1附近时，出现明显的突跃点，当盐酸胍浓度大于4.3 mol·L-1时，其波长红移至354 nm处，显示色氨酸完全暴露于水，蛋白二级结构已经瓦解。

根据“两态模型”[5-7]，变性过程中β-LG只以未变性状态N(nature)或完全变性状态D(denature)存在。有如下平衡存在：

(1)

YN+YD=1

(2)

YN，YD分别为未变性以及变性的摩尔分数。

F=YN·FN+YD·FD

(3)

FN，FD分别代表未变性以及完全变性时β-LG的荧光强度，F为任一实验点测量的荧光强度。

按照式(3)计算各实验点变性百分数，并作图。

图2　盐酸胍对β-LG构象稳定性的影响(CLG=1×10-6 mol·L-1)

如图2所示：起始时β-LG的变性较不明显，当盐酸胍浓度大于4 mol·L-1时β-LG完全变性。

由式(2)、(3)可得到式(4)、(5)：

YD=(F-FN)/(FD-FN)

(4)

YN=(FD-F)/(FD-FN)

(5)

(6)

(7)

根据式(7)可求出各点变性自由能ΔGD。

(8)

按照式(7)、(8)计算每个实验点的吉布斯自由能ΔGD。

图3　盐酸胍对蛋白构象吉布斯自由能的影响

2.2AN结合对β-LG构象的影响

2.2.1β-LG与AN的结合

在β-LG溶液中逐渐滴加AN，结果发现β-LG荧光强度随着AN增加而逐渐减弱；反之，在AN 溶液中逐渐滴加β-LG，结果发现AN的发射峰从440紫移至420 nm，荧光强度也逐渐增强，如图4所示。从滴定曲线(图5)可看出，当两者比例在1:1附近，AN的荧光强度增强变缓，从而推断，两者间形成1:1复合物。

图4　不同浓度β-LG中AN的荧光变化

图5　β-LG对AN的滴定曲线

2.2.2与AN的结合的β-LG在盐酸胍中的构象变化

在β-LG-AN复合物(CLG:CAN=1:1)溶液中逐渐加入盐酸胍，发现蛋白的最大发射波长也逐渐红移，变化趋势如图6所示。

图6　盐酸胍浓度对β-LG-AN中蛋白发射波长的影响(CLG=1×10-6 mol·L-1，CAN=1×10-6 mol·L-1)

按照式(3)把图6转化为变性曲线，并计算不同浓度盐酸胍下蛋白的吉布斯自由能如图7所示。

图7　盐酸胍对β-LG-AN复合物中蛋白吉布斯自由能的影响

2.3尿素对β-LG构象的影响

在尿素中比较 β-LG与 β-LG-AN的变性曲线，可以看出：类似于在盐酸胍中，蛋白结合小分子AN后，Cm从4.3 提高到5.0 mol·L-1附近，蛋白稳定性明显增强。通过计算二者在不同尿浓度下的吉布斯自由能，推出空蛋白β-LG与 结合配体后的β-LG-AN稳定化能分别为14.250和17.736 kJ/(mol·L-1)，与盐酸胍溶液中推出的结果基本一致。

图8　β-LG (a)与 β-LG-AN (b) 在盐酸胍中的变性曲线(A)和不同浓度盐酸胍下两者的吉布斯自由能图 (B)

3　结　论

[1]MCKENZIE H A, SAWYER W H. Effect of pH on β-Lactoglobulins[J]. Nature, 1967, 214：1101-1104.

[2]STOJADINOVIC M, RADOSAVLJEVIC J, OGNJENOVIC J, et al. Binding affinity between dietary polyphenols and β-lactoglobulin negatively correlates with the protein susceptibility to digestion and total antioxidant activity of complexes formed[J]. Food Chemistry, 2013, 136:1263-1271.

[3]SHI L, PALLEROS D R, FINK A L. Protein conformational changes induced by 1,1’-bis(4-anilino-5-naphthalenesulfonic acid): preferential binding to the molten globule of DnaK[J]. Biochemistry, 1994, 33(24):7536-7546.

[4]马林,何维仁,黄爱民,等. 丝素蛋白在甲醇-水混合溶剂中构象变化的光谱学研究[J]. 光谱 学与光谱分析,2010,30(11):3047-3051.

[5]李向荣,郭伟,卢雁.牛血清蛋白在盐酸胍和尿素体系中变性的微量热研究[J].化学学报,2008,66(5): 515-519.

[6]LI H, ZHAO Y, YANG B. Fluorescence Spectra Study the Perturbations of CopC Native Fold by 2-p-Toluidinynaphthalene-6-sulfonate Spectrochimica[J]. Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2009, 72:56-60.

[7]郭晓娜,姚惠源.光谱法研究变性剂对苦荞麦蛋白质构象的影响[J]. 光谱学与光谱分析,2011,31(6):1611-1614.

Spectra Study on the Stability of β-lactoglobulin*

JIA Hui， WANG Zhi-qing， WEI Jing， DONG You-ming， YU Zhi-yue， LI Hui-qing

(Chemistry Department, Xinzhou Teachers’ University, Shanxi Xinzhou 034000, China)

The stability of β-lactoglobulin (β-LG)in guanidine hydrochloride(GuHCl) acid or nrea solution was investigated by fluorescence spectroscopy at room temperature in pH 7.0 phosphate buffer. The denaturation transition midpoint of β-LG in GuHCl (Cm) was 2.3 mol·L-1, the free energy of stabilization was 14.051 kJ/(mol·L-1). β-LG can binding N-phenyl-1-naphthylamine (AN). Thus, the free energy of stabilization was increased to 17.443 kJ/(mol·L-1), and it was consistent with the free energies of stabilization of the β-LG (14.250 kJ/(mol·L-1)) and β-LG-AN complex (17.736 kJ/(mol·L-1)) obtained from urea.

β-lactoglobulin；N-phenyl-1-naphthylamine；the free energy of stabilization

山西省自然基金项目(No:2014011014-2)；山西省高等学校大学生创新创业训练项目(No:2014393)；忻州师院化学化工创新基地项目。

李慧卿(1972-)，女，博士，副教授，主要从事生物分子研究。

O657

A

1001-9677(2016)01-0048-03