鸡肉干中金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺残留量的测定

王智玮

(上海天祥质量技术服务有限公司，上海　200233)



鸡肉干中金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺残留量的测定

王智玮

(上海天祥质量技术服务有限公司，上海200233)

采用固相萃取柱对样品中的金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺进行浓缩与净化，建立了一种灵敏测定鸡肉干中金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺残留量的超高效液相色谱-质谱串联仪法。试验结果表明，采用MCX固相萃取柱进行富集与净化，金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺在1～20 μg/L浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系，检出限均为0.5 μg/kg。该方法分析速度快，灵敏度高，重复性好，适用于动物源食品中金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺残留量的测定。

金刚乙胺；3,5-二甲基金刚胺；美金刚；超高液相色谱-串联质谱法

金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺，属于金刚烷胺类，3,5-二甲基金刚胺又称美金刚。金刚烷胺类属于三环胺类抗病毒药物，在人类上有广泛应用。据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺类药物用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。但是，将人用抗病毒药物用于畜禽，不仅容易导致动物性食品中药物残留、动物中毒、动物机体产生免疫抑制和耐药性等问题，还可导致病毒发生变异， 影响动物疫病控制及人用抗病毒药物的有效性[1-3]。我国于2005 年 12 月发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等抗病毒药作为兽用药，但由于其价格低廉、效果良好，仍有不法分子大量使用金刚烷胺类药物用于动物疾病的预防和治疗。滥用金刚烷胺类药物会导致动物中毒，使病毒产生不同程度的耐药性，并诱发病毒产生变异，严重影响了国家动物疫病防控工作[4]。我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道较少，少数的报道主要集中在液相色谱法[5]、气相色谱法[6-10]和液相色谱-串联质谱法[11-15]，也未曾制定或立项过国家标准。因此，研究建立动物源食品中金刚烷胺类的残留检测方法具有重要意义。

1　实　验

1.1仪器与试剂

AB 4500超高效液相色谱-质谱联用仪；XS105分析天平，METLER；XW-80A涡旋混合器，上海精科；SF-DL-4M冷冻离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；SK3300HP超声波清洗器，KUDOS；N-EVAP111氮吹仪，ASSOCIATES；57265固相萃取装置，SUPELCO。

甲醇、异丙醇和甲酸为色谱纯，盐酸、正己烷、三氯乙酸、氨水和乙酸铵为分析纯，实验用水为去离子水。盐酸金刚乙胺、3,5-二甲基金刚胺和盐酸金刚烷胺-D15,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2标准溶液配制

1.2.1标准储备液

准确称量1.0 mg金刚烷胺-d15标准品至5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀，浓度为200 μg/mL。-18 ℃保存12个月。

分别准确称量金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺标准品至50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀，浓度均为200 μg/mL。-18 ℃保存12个月。

1.2.2标准中间液

精确吸取金刚烷胺-d15储备液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混匀，浓度为1.0 μg/mL。-18 ℃保存6个月。

精确吸取标准储备液0.25 mL至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，混匀，金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺浓度均为1.0 μg/mL。-18 ℃保存6个月。

1.2.3标准工作液的配制

从标准中间液中分别吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL至10 mL容量瓶中，再从金刚烷胺-d15标准中间液中分别吸取0.25 mL至10 mL容量瓶中，用水定容，混匀，金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺浓度为1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，内标金刚烷胺-d15浓度为25.0 ng/mL。标准工作液现配现用。

1.3样品制备

准确称取2 g(精确到0.01 g)试样至50 mL塑料离心管中，加入内标(金刚烷胺-D15，浓度为1.0 μg/mL)0.025 mL，再加入10 mL甲醇：1%三氯乙酸(1:1)，涡旋振荡1 min，超声30 min，4000 r/min冷冻离心15 min。上清液转移至另一50 mL 离心管中，加入5 mL正己烷轻微振摇3 min，4000 r/min冷冻离心5 min，除去上层正己烷层，取下层液待净化。取下层液转移至已活化(用3 mL甲醇，3 mL水活化)MCX固相萃取柱中，依次用3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液、3 mL甲醇淋洗，弃去全部流出液，在负压下干燥5 min，然后用5 mL氨水-甲醇-异丙醇(5+80+15)洗脱。收集洗脱液于45 ℃ 氮吹至干，精密加入1 mL水至残渣中，涡旋振荡溶解残渣，如浑浊，以13000 r/min离心10 min，取上清液供LC-MS/MS测定。

1.4仪器条件

1.4.1液相条件

色谱柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)或相当者；

流动相：A相5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)，B相甲醇。

流速：0.3 mL/min；

进样量：5 μL；

柱温：30 ℃。

表1　流动相梯度条件Table 1　The elution conditions of mobile phase

1.4.2质谱条件

离子源：电喷雾ESI离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式： MRM；

电喷雾电压：5500 V ；

雾化气压力：50 psi；

气帘气压力：35 psi；

辅助气压力：50 psi；

碰撞气压力：9 psi；

离子源温度：500 ℃；

碰撞室入口电压：10 V；

碰撞室出口电压：6 V。

监测离子对情况见表2。

表2　金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺及金刚烷胺-d15的离子对Table 2　The MS parameters for detecting rimantadine and memantine

2　结果与讨论

2.1线性关系及检出限

表3　测试结果Table 3　Testing results of calibration curve

图1　金刚乙胺标准曲线Fig.1　The standard curve of rimantadine

图2　3,5-二甲基金刚胺标准曲线Fig.2　The standard curve of memantine

准确移取金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺储备液适量，用水稀释成一系列的标准工作液，其浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L。以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。平行测定10次空白试剂加标(1.0 ng/mL)的标准偏差为Sb，检出限CL=3Sb，得出该方法的检出限为0.5 μg/kg。

线性方程为：

金刚乙胺：y=0.03498x+0.00537 (r=0.99974)

3,5-二甲基金刚胺:y=0.02640x+-0.00168(r=0.99985)

2.2回收率

本方法选择鸡肉干作为加标基质。分别选取0.5 μg/kg、2.5 μg/kg、10 μg/kg进行加标回收实验，每个水平重复测定7次，加标情况见表4、表5，回收率见表6、表7。

表4　鸡肉干中金刚乙胺的加标情况Table 4　Measured values of Rimantadine in chicken dry

表5　鸡肉干中3,5二甲基金刚胺的加标情况Table 5　Measured value of Memantine in chicken dry

表6　鸡肉干中金刚乙胺加标回收Table 6　The recovery rate of Rimantadine in chicken dry

表7　鸡肉干中3,5-二甲基金刚胺加标回收Table 7　The recovery rate of Memantine in chicken dry

表8　基质加标一览表Table 8　The recovery rate list

2.3实验谱图

2.3.1标准物质色谱图(0.5 ng/mL)

图3　0.5 ng/mL标准物质色谱图Fig.3　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine (0.5 ng/mL)

金刚乙胺和3,5二甲基金刚胺为同分异构体，4.85 min为金刚乙胺，5.02 min为3,5-二甲基金刚胺。

2.3.2空白基质色谱图(鸡肉干)

图4　空白基质色谱图(鸡肉干)Fig.4　The UPLC-MS/MS of blank sample(chicken dry)

2.3.3空白样品(鸡肉干)加标色谱图(加标浓度0.5 μg/kg)

图5　空白样品加标色谱图Fig.5　The UPLC-MS/MS of rimantadine and memantine in samples after adding standard concentration

2.4精密度分析

同回收率部分选择鸡肉干作为加标基质。进行三个水平加标回收实验，每个水平重复测定7次，基质添加回收的变异系数(CV)与GB/T 27404-2008要求的变异系数(CV)范围比较见表9和表10。

表9　基质添加回收的变异系数与GB/T 27404-2008要求的 变异系数范围比较(金刚乙胺)Table 9　The comparison of coefficient of variation (rimantadine)

表10　基质添加回收的变异系数与GB/T 27404-2008要求的 变异系数范围比较(3,5-二甲基金刚胺)Table 10　The comparison of coefficient of variation (memantine)

3　结　论

本实验采用弱酸性溶液提取，固相萃取法进行净化与富集，运用UHPLC-MS/MS技术对金刚乙胺和3,5-二甲基金刚胺进行测定。固相萃取法能够更有效的分离分析物与杂质，回收率以及富集倍数高，有毒溶剂用量少，通过简单的操作就能达到无相分离，提升了前处理操作安全性，节省了前处理时间，提高了实验效率。本法的检出限、回收率、精密度能够满足实验要求。相较传统的化学方法而言，本方法快速、高效、重现性好，可以应用于常规分析检测。

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Determination of Rimantadine and Memantine Residues in Chicken Dry by UHPLC-MS/MS

WANG Zhi-wei

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

A simple, fast, accurate method for determination of rimantadine and memantine in chicken dry was developed by ultra high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The sample was concentrated by solid phase extraction column. The linear range of the method was from 1 μg/L to 20 μg/L with a good correlation coefficient, and the detection limit was 0.5 μg/kg. The proposed method exhibited high sensitivity and good reproducibility for determining rimantadine and memantine.

rimantadine;3,5-dimethyl amantadine; memantine; UHPLC-MSMS

王智玮(1990-)，检测工程师，主要从事食品检测。

TS207.3

A

1001-9677(2016)09-0120-04