大孔树脂混用技术分离纯化竹叶黄酮的工艺研究*

周健飞，陶文亮

(1 贵州大学化学与化工学院，贵州　贵阳　550025; 2 贵州工程应用技术学院，贵州　毕节　551700)



大孔树脂混用技术分离纯化竹叶黄酮的工艺研究*

周健飞1，陶文亮2

(1 贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025; 2 贵州工程应用技术学院，贵州毕节551700)

采用大孔树脂混合使用技术,用于分离纯化竹叶黄酮的工艺研究。通过研究8种大孔树脂对竹叶黄酮的静态吸附与解吸实验，筛选出两种较好的树脂D101-1和AB-8，采用混用技术进行实验，结果表明：D101-1与AB-8的最优混合比例为2:1；上样液质量浓度1.2 mg/mL、上样量为3.5 BV、上样流速2 BV/h为最佳上样条件，洗脱剂体积分数70%、洗脱体积4 BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。在此条件下进行纯化实验，分离纯化效果最好，样品中黄酮纯度由原来的8.46%上升至28.16%。

竹叶黄酮；纯化；大孔吸附树脂；混用技术

竹子是禾本科、竹亚科多年生常绿植物，在我国具有悠久的食用和药用历史。全世界竹子约有70多属、1250多种，其中53%分布在中国。竹叶黄酮是一种安全无毒副作用[1]的天然抗氧化剂，其抗氧化作用可替代银杏提取物、茶叶提取物和葡萄籽提取物，已列入国标GB30615-2014，被卫生部批准作为天然食品抗氧化剂使用。此外，竹叶黄酮还具有清除自由基[2]、抗氧化[3]、防衰老[4]和预防老年痴呆，抗炎，杀菌[5-6]，抗肿瘤[7]，肝肌保护[8]，降低心脑血管疾病发生的危险[9]等多种生物学功效。

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂，具有选择性好、吸附量大、吸附速率快、机械强度高、易再生等优点，已被广泛运用于天然产物黄酮类化合物的分离纯化[10-12]。目前关于两种及多种树脂混用在天然产物分离纯化上的运用研究已有相关报道[13-15]，而关于大孔树脂在竹叶黄酮类化合物的分离纯化的研究多为单一树脂的研究，未见多种树脂的混用技术的研究报道。

本研究采用大孔树脂混用技术，在8种大孔吸附树脂中选取两种进行混合，对竹叶黄酮进行分离特性的研究，分离纯化效果好，样品中黄酮纯度得以大大提高，为竹叶黄酮的纯化提供了新方法，具有较好的应用价值，对竹叶资源的利用具有重要意义。

1　实　验

1.1材料、试剂与仪器

竹叶采于2013年贵州赤水,并通过自然风干，备用。

芦丁标准品(中国食品药品检定研究院；批号：100080-201409)；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、乙醇、甲醇、盐酸均为国产分析纯；大孔吸附树脂(D101-1、D101、AB-8、DM130、DM301、ADS-17、S-8)来自安徽三星树脂有限公司、NKA-9来自沧州宝恩树脂有限公司。

恒温水浴锅、旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-IV循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；恒温循环器，北京博医康实验仪器有限公司；JC-100恒温培养振荡器，上海精旭实业有限公司；酒精计，河北省武强县同辉仪表厂；JF1204电子分析天平，余姚市金诺天平仪器有限公司；101-1AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UV-6100S紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；雷磁PHS-25pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；玻璃层析柱。

1.2实验方法

1.2.1竹叶黄酮提取方法

取干燥未粉碎的竹叶，先按料液比1:20(g/mL)加入50%乙醇提取一次分离固液后，再以料液比1:15(g/mL)进行二次提取.合并两次提取液，醇沉过夜以除去糖类、蛋白质等，浓缩至一定浓度，备用。

1.2.2树脂处理方法

先用体积分数95%乙醇溶液充分浸泡过夜，然后用无水乙醇洗至洗出液加适量水后无白色浑浊，再用去离子水洗至洗出液无醇味，转入酸碱处理，用4 BV的5%HCL溶液以5 BV/h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至pH值为中性，用4 BV的5%NaOH溶液以5 BV/h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至pH值为中性，浸泡于95%乙醇中备用，使用前用水洗至无醇味。

1.2.3竹叶黄酮的测定方法

1.2.3.1标准曲线的绘制

由于芦丁和黄酮类化合物都是以 2-苯基色原酮为母核，具有相同的吸光度测试性质，故用芦丁为标准品，采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法测定总黄酮含量[16]。精确称量0.0150 g芦丁标准品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀得浓度为0.15 mg/mL的标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL于25 mL具塞比色管中，用30%乙醇补齐至10 mL，加0.7 mL 5%NaNO2溶液摇匀放置5 min后，加入0.7 mL 10% Al(NO3)3溶液摇匀6 min后，再加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，摇匀，用30%乙醇定容至刻度。静止15 min后置于分光光度计于510 nm处测吸光度A，记录数值。以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，所得线性标准回归方程为y=11.66071x+0.00186,相关系数R2=0.99972。

1.2.3.2样品含量及纯度的测定

取一定量待测试样溶液，按绘制标准曲线的步骤，于510 nm处测定吸光度，根据标准曲线方程计算样品黄酮浓度。

竹叶黄酮精制后于50 ℃条件放置烘箱干燥至恒重，取精制产品100 mg,用30%乙醇溶解并定容至100 mL,摇匀待测其黄酮浓度。

(1)

1.2.4单一大孔吸附树脂的筛选

1.2.4.1静态吸附与解吸实验

准确称取1 g已处理好的8种吸附树脂(用滤纸吸干后称重)装入100 mL锥形瓶中，精密加入30 mL质量浓度0.8 mg/mL竹叶黄酮样品溶液，于25 ℃下置恒温培养振荡器中振荡吸附24 h,过滤，测定剩余黄酮的质量浓度，按式(1)、(2)计算吸附量和吸附率；吸附后的树脂用滤纸吸干后加入30 mL 的95%乙醇,在25 ℃下置恒温培养振荡器中振荡解吸24 h，过滤测定洗脱液中黄酮质量浓度，按式(3)、(4)计算其解吸率。

(2)

(3)

(4)

1.2.4.2静态吸附与解吸动力学实验

根据1.2.4.1结果所示，选择其中2种较理想的树脂进行静态吸附与解吸动力学实验。按1.2.4.1的方法，每隔1 h取样检测，测定其中吸附液剩余黄酮浓度,以树脂对黄酮的吸附量与时间作图，绘制大孔树脂静态吸附动力学吸附曲线及静态动力学解吸曲线。

1.2.5混合大孔吸附树脂比例的筛选

将上述两种效果较好的树脂以一定质量比混合，按1.2.4.1的方法，于25 ℃下置恒温培养振荡器中振荡吸附5 h，解吸4 h，按公式(1)～(4)计算吸附量、吸附率和解吸率。筛选出最优树脂混合比例。

1.2.6混合大孔吸附树脂静态吸附、解吸实验

1.2.6.1上样液质量浓度对吸附效果的影响

各取30 mL上样液质量浓度分别为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的竹叶总黄酮提取液。加入1 g树脂(AB-8:D101-1=1:2)，于25 ℃下恒温振荡吸附5 h，取一定量上层清液按绘制标准曲线的方法测定其总黄酮浓度，计算其吸附率和吸附量。

1.2.6.2洗脱液体积分数对解吸率的影响

将吸附饱和的1 g树脂(AB-8:D101-1=1:2)用滤纸吸干后，分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各30 mL。下同1.2.6.1，计算其解吸率。

2　结果与讨论

2.1单一大孔吸附树脂的筛选

2.1.1静态吸附与解吸实验

竹叶黄酮具有一定的酚羟基且有一定的极性，而大孔吸附树脂是种表面吸附剂，吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即树脂的极性(功能基)和空间结构(孔径、比表面积、孔容等),由于不同树脂结构性质的不同，从而对竹叶黄酮树脂的吸附解吸难易程度不同。由表1可知，如D101-1型树脂吸附效果较好，吸附率达到71.04%； S-8型树脂虽然吸附效果最好，但是其解吸效果较低；而解吸率最高的是AB-8型树脂达95.07%。综合考虑黄酮的吸附率、解吸率，本实验拟采用D101-1和AB-8两种树脂按一定比例混合，筛选出对竹叶黄酮分离纯化效果更好的树脂混合比例。

表1　8种树脂对竹叶黄酮的吸附和解吸效果Tabel 1　Results of adsorption and desorption capacity of bamboo leaf flavonoids on eight macroporous resins

2.1.2静态吸附与解吸动力学实验

分别考察其静态吸附解吸动力学特性，结果如图1、图2所示，D101-1与AB-8两种大孔树脂能够达到快速吸附与解吸平衡，在5 h时，D101-1与AB-8的吸附量分别是15.37 mg/g和15.09 mg/g，基本达到吸附平衡；在4 h时，D101-1与AB-8的洗脱液浓度分别是0.490 mg/mL和0.487 mg/mL，基本达到解吸平衡。

图1　D101-1与AB-8两种大孔树脂对竹叶黄酮的静态吸附动力学吸附曲线Fig.1　Static adsorption kinetic curves of D101-1 and AB-8 macroporous resins towards bamboo leaf flavonoids

图2　D101-1与AB-8两种大孔树脂静态吸附动力学解吸曲线Fig.2　Static desorption kinetic curves of D101-1 and AB-8 macroporous resins towards bamboo leaf flavonoids

2.2混合大孔吸附树脂比例的筛选

大孔树脂对竹叶黄酮的吸附作用与其空间结构和功能团息息相关，考虑到不同树脂的协同作用和空间结构参数的不同，通过不同比例树脂的混合，混合树脂的空间结构和功能团有所差异。由表2可知，当两种树脂以一定比例混合时，其不同的吸附率和解吸率作为判断对竹叶黄酮分离纯化效果的标准，当AB-8:D101-1=1:2时，吸附率与解吸率均较高所以选择以此比例混合后对竹叶黄酮进行分离纯化。

表2　不同混合树脂比例对竹叶黄酮吸附与解吸效果Tabel 2　comparison of adsorption and desorption capacities of D101-1:AB-8 mixtures in different proportions towards bamboo leaf flavonoids

2.3不同条件下混合大孔吸附树脂对竹叶黄酮纯化工艺的实验

2.3.1上样液质量浓度对吸附效果的影响

大孔树脂对竹叶黄酮溶液吸附过程是一种液固吸附过程，而液固之间的吸附不仅存在吸附剂与溶质之间的作用，还存在溶质-溶质、溶质-溶剂、溶剂-吸附之间的作用[17]。由图3可知，随着上样液浓度的增加，吸附率逐渐降低，吸附量逐渐增大。综合考虑黄酮的吸附率与树脂的吸附量，选择最适上样液浓度为1.2 mg/mL。

图3　不同上样液质量浓度对树脂吸附性能的影响Fig.3　Effect of sample concentration on adsorption properties

2.3.2洗脱剂体积分数对解吸率的影响

常用的洗脱剂多为甲醇、乙醇、丙酮等，由于乙醇安全、无毒、易回收等优点，本实验选择乙醇作为洗脱剂，通过静态吸附解吸实验，吸附5 h后，考察不同乙醇体积分数对竹叶黄酮分离纯化的影响，如图4所示。从图4中可以看出，随着乙醇体积分数的增加，解吸率先增加后减少，在70%时解吸率达到最大值90.81%。当体积分数大于70%时解吸率降低，这是由于当乙醇浓度过高时，醇溶性杂质增加，降低洗脱液中黄酮纯度。

图4　乙醇体积分数对解吸效果的影响Fig.4　Effect of ethanol concentration on desorption quantity

2.3.3最佳上样体积的确定

取1.2 mg/mL竹叶黄酮提取液，以2 BV/h流经层析柱。每0.5BV为一收集段收集流出液，测定其黄酮质量浓度，绘制其泄漏曲线如图5所示。流出液黄酮浓度随着上样量的增加而增加，则吸附率逐渐降低；而上样量过少时，树脂的吸附量减小，树脂利用率降低。综合考虑树脂的吸附率与树脂的吸附量，选择3.5 BV为最佳上样量体积。

图5　竹叶黄酮的泄漏曲线Fig.5　Leakage curve of bamboo flavounoids

2.3.4最佳上样流速的确定

上样液通过树脂床的流速对树脂的吸附效率及生产效率均有着一定的影响。本实验通过控制不同流速考察对吸附效果的影响，将树脂(AB-8:D101-1=1:2)装柱，竹叶黄酮上样量浓度1.2 mg/mL，上样量3.5 BV，分别以1 BV/h、 2 BV/h、3 BV/h、 4 BV/h、 5 BV/h的流速流经层析柱，测定吸附过程中流出液的黄酮质量浓度，计算黄酮吸附总量。结果如图6所示。随着上样流速的增加，吸附量降低，反之，流速降低，有利于总黄酮的吸附，但会影响生产效率，增加吸附时间，生产周期和成本增加。综合考虑树脂的处理量和黄酮的利用率，选择2 BV/h为最佳上样流速。

图6　上样流速对树脂吸附量的影响Fig.6　Effect of sample loading velocity on adsorption quantity

2.3.5最佳洗脱体积的确定

按确定的最佳吸附条件上柱，用1 BV水洗去水溶性杂质，再用70%乙醇作为洗脱剂以2 BV/h的流速洗脱，每0.5 BV作为一收集段收集洗脱液，检测其中总黄酮质量浓度，绘制洗脱曲线如图7所示。当洗脱体积达到4 BV时，洗脱液中黄酮浓度接近于0，考虑到洗脱效率与洗脱剂用量，选择4 BV为最佳洗脱体积。

图7　洗脱曲线Fig.7　Dynamic desorption curve

2.3.6最佳洗脱流速的确定

按确定的吸附条件上柱，先用1 BV水洗去水溶性杂质，用4 BV的70%乙醇分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h的速度进行洗脱。测定洗脱液总黄酮质量浓度计算解吸率，如图8所示。不同的流速对其解吸效果影响不大，考虑洗脱时间不至于过长，选用2 BV/h为最佳洗脱流速。

图8　洗脱流速对树脂解吸性能的影响Fig.8　Effect of elution flow rate on desorption rate

2.4混合树脂纯化工艺验证实验

上样条件：上样质量浓度1.2 mg/mL，上样量体积3.5 BV，上样流速2 BV/h；洗脱条件：洗脱剂体积分数70%，4 BV洗脱剂体积，洗脱流速2 BV/h。以此条件对竹叶黄酮进行精制，收集洗脱液经旋转蒸发器浓缩后烘干。测得其黄酮纯度为28.16%，与纯化前黄酮纯度8.46%相比，纯度为原来的3.3倍。纯化效果显著。

3　结　论

在8种大孔吸附树脂中选取两种(D101-1与AB-8)，采用混用技术进行分离纯化竹叶黄酮工艺条件考察，结论如下：D101-1与AB-8以2:1比例混合，上样液质量浓度1.2 mg/mL、上样量为3.5 BV、上样流速2 BV/h条件下上柱吸附、洗脱剂体积分数70%、洗脱体积4 BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。比较纯化前后黄酮纯度，较纯化前8.46%，纯化后黄酮纯度为28.16%，纯度为原来的3.3倍。大孔树脂混用技术为竹叶黄酮的纯化提供了新方法，具有较好的应用价值。

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Separation and Purification of Flavonoids from Bamboo Leaves by Mixed Macroporous Resins Technique*

ZHOU Jian-fei1, TAO Wen-liang2

(1 College of Chemical and Chemical Engineering, Guizhou University, Guizhou Guiyang 550025;2GuizhouUniversityofEngineeringScience,GuizhouBijie551700,China)

The macroporous resins mixing technology was used for separation and purification of flavonoids from bamboo leaves technology research. To screen two kinds of better resin for separation and purification of flavonoids from bamboo leaves by using mixed technology experiment, 8 macroporous resins were compared by the static adsorption and desorption experiments, D101-1 and AB-8 were found more suitable to separate and purify flavonoids. Experimental results showed that the optimal mixing ratio of D101-1 to AB-8 was 2:1. The best of loading conditions by loading 3.5 BV(bed volume) of the sample concentration 1.2 mg/mL onto the mixed column at a flow rate of 2 BV/h and eluting the column with 4 BV of 70% ethanol at a flow rate of 2 BV/h. The effect of purification experiment under these conditions was best, the sample flavonoids purity increased from 8.46% to 28.16%.

flavonoids from bamboo leaves; purification; macroporous resins; mixing technology

贵州大学博士基金项目“赤水地区竹叶黄酮的提取分离与纯化关键技术”[贵大人基合字(2008)001]。

周健飞(1992-)，男，在读硕士，研究方向：化工分离技术开发研究。

陶文亮，男，教授，博士，研究方向为化工分离过程研究。

Q946

A

1001-9677(2016)09-0069-05