党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肝脾形态结构和Bax蛋白及VEGF表达的影响

王　晶，王　勇*，李海龙，杨雅丽

(甘肃中医药大学医学技术学院，甘肃兰州　730000)



党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肝脾形态结构和Bax蛋白及VEGF表达的影响

王晶，王勇*，李海龙，杨雅丽

(甘肃中医药大学医学技术学院，甘肃兰州730000)

为研究党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏和脾脏组织结构及Bax蛋白及VEGF表达的影响，将100只昆明小鼠随机分为对照组、D-半乳糖致衰老模型组、低、中、高剂量党参干预组.连续处理42d，随时监测小鼠的体重变化，处理结束后，称取脏器质量，观察组织显微结构，并用免疫组织化学法检测Bax蛋白和VEGF在肝脏和脾脏组织的表达.结果显示衰老组小鼠肝脏和脾脏指数明显下降(P<0.05).多数肝细胞水肿，胞浆空淡，呈气球样变.脾窦明显扩张，红髓范围扩大，脾小梁明显增生.Bax蛋白表达明显增强，VEGF蛋白表达显著减少.与衰老组相比，党参干预高剂量组的脏器指数明显增加(P<0.05)，肝小叶结构清楚，肝细胞体积增大，肝细胞水肿明显减轻.白髓红髓清楚，红髓范围减小，脾小梁增生不明显.Bax蛋白表达明显减少，VEGF蛋白表达明显增加.表明党参水提物可以稳定肝脾的组织结构，抑制细胞凋亡，促进血管生成，对衰老小鼠的肝脏和脾脏组织有一定的保护作用.

党参；衰老；组织形态；Bax；VEGF

人体以五脏为中心，在衰老过程中，五脏功能的减退是主要的变化.在五脏中，肝脏负责造血功能，脾脏与免疫系统有关，所以，二者与衰老的关系日益受到重视[1].研究表明，在脏器的衰老过程中细胞凋亡起着非常重要的作用，而且会逐渐出现血管生成的障碍[2-3].甘肃地道药材党参(Codonopsis pilosula，CPPS)，味甘性平、补中益气，具有提高人体免疫力，抗肿瘤、抗疲劳、延缓衰老的功效，临床应用日趋广泛[4].Bax蛋白是一种促进细胞凋亡的蛋白，VEGF可促进血管新生，Bax蛋白和VEGF表达的变化在一定程度上可反映组织的衰老情况.本实验用免疫组织化学方法检测党参水提物对D-乳糖致衰老模型小鼠肝脾组织BCL-2相关X蛋白(BCL2-associatedXprotein，Bax)和血管生成因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)表达的影响，从而探讨党参延缓衰老的作用机制.

1　材料与方法

1.1主要药品与仪器

党参，采自甘肃岷县，经甘肃中医药大学中药资源教研室鉴定为白条党参.取党参100g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1h，第2次加6倍水煎煮1h，合并两次提取液，过滤后，浓缩成含生药5×10-4g·L-1的水煎剂，置4 ℃冰箱备用，水煎液每5d制备1次.D-半乳糖(Sigma产品)，临用前用生理盐水配制成12g·L-1备用.兔VEGF多克隆抗体、兔Bax蛋白多克隆抗体(北京中杉金桥公司).兔、小鼠免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司).

1.2动物分组及处理

SPF级昆明小鼠100只，2月龄，雌雄各半，体质量(18±2)g，购自甘肃中医药大学科研实验动物中心.适应性喂养7d后，分笼群养，自由饮水、摄食，自然光照，室温20～25 ℃.将小鼠随机分为对照组、衰老模型组和低、中、高剂量党参干预共5组，每组20只，雌雄各半.衰老模型组和低、中、高剂量党参干预组，每日每只小鼠颈背部皮下注射50g·L-1的D-半乳糖溶液，对照组注射等体积量生理盐水.党参干预组采用灌胃给药法，每日上午按相当于生药量5,10,15g·kg-1剂量给药，对照组和衰老模型组灌服等体积生理盐水，以上连续处理42d.

1.3组织切片制备

于末次给药2h后，用10%水合氯醛麻醉动物，取肝脏和脾脏称量质量，分别统计脏器指数.将肝、脾组织置于10%福尔马林液固定48h，常规石蜡切片，苏木精-伊红染色，封片后光镜观察.

1.4免疫组化染色

3μm石蜡切片脱腊入水,3%过氧化氢孵育15min，抗原修复,正常山羊血清封闭.加入稀释的一抗(兔VEGF多克隆抗体1∶50稀释，兔Bax蛋白多克隆抗体1∶100稀释)，4 ℃过夜.加入生物素标记的二抗，室温下孵育20min.加入辣根过氧化物酶室温孵育20min.二氨基联苯显色5min，苏木素衬染，脱水、透明封片.每组染色均设不加一抗的阴性对照.VEGF和Bax阳性判定标准以细胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性标准.

1.5数据采集与处理

从各组免疫组织化学切片中选择典型的图片10张，用ImageProPlusV6 图像分析软件检测免疫组织化学阳性反应产物的光密度.实验数据用Excelt统计分析，结果用均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差别有统计学意义.

2　结果

2.1肝、脾指数

与正常对照组相比，衰老模型组脾脏指数降低，差别有统计学意义(P<0.05)；与衰老模型组相比，党参干预3个剂量组脾脏指数均升高，高剂量党参干预组与衰老模型组相比脾脏指数升高显著(P>0.05).与正常对照组相比，衰老模型组肝脏指数下降，差异显著(P<0.05)；与衰老模型组相比，党参干预3个剂量组肝脏指数均有增高趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)(表1).

2.2组织病理分析

在HE染色切片上，对照组小鼠肝细胞为典型多边形腺上皮细胞，以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，肝细胞边界清晰，细胞形态完整、整齐；衰老模型组小鼠肝细胞排列紊乱，胞浆疏松化，核固缩；党参低剂量干预组小鼠肝细胞形态依然不齐，胞浆疏松；党参中剂量干预组小鼠肝脏组织部分细胞结构恢复正常，但距离中央静脉略远处细胞排列较乱，胞浆疏松化明显；党参高剂量干预组肝细胞变性明显改善，细胞边界较为清晰，形态较完整，细胞排列也较为整齐(图1A～E).

表1　小鼠的肝和脾指数

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与衰老模型组相比，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

图1　小鼠肝脾显微结构

A～E.分别为对照组、衰老模型组、低剂量党参干预组、中剂量党参干预组、高剂量党参干预组小鼠肝脏光镜结构；F～J.分别为对照组、衰老模型组、低剂量党参干预组、中剂量党参干预组、高剂量党参干预组小鼠脾脏光镜结构；CHV.中央静脉；RP.红髓;TCL;脾小梁;WP.白髓;标尺=20μm.

A～E.Lightmicroscopestructureofliverinnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;F～J.Lightmicroscopestructureofspleeninnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,highdoseofCPPSinverventionalgroupmice;CHV.centralhepaticvein;RP.redpulp,TCL.trabeculaelienis,WP.whitepulp.Bar=20μm.

对照组小鼠脾脏结构完整，白髓和红髓清晰，脾小梁没有增生；衰老模型组小鼠白髓红髓不清，脾小梁明显增生；低剂量党参干预组小鼠脾窦有扩张，脾小梁增生明显；中剂量党参干预组小鼠脾脏组织改善不大，脾小梁仍有增生；高剂量党参干预组小鼠脾脏结构正常，白髓红髓清楚，红髓范围扩大，脾小梁增生不明显(图1F～J).

2.3Bax蛋白表达的变化

免疫组织化学显示Bax蛋白定位于肝细胞质中，其中衰老模型组肝细胞Bax蛋白的表达阳性率明显高于对照组(P<0.05)；与衰老模型组比较，高剂量党参干预组小鼠Bax蛋白表达阳性率下降(P<0.05)，棕黄色细胞数量减少，染色较浅；中低剂量党参干预组Bax蛋白表达减少,差异不显著(P>0.05)(图2A～E和表2).

在脾组织中，衰老模型组Bax蛋白的表达阳性率明显高于正常对照组(P<0.05)；与衰老模型组比较，高剂量党参干预组小鼠Bax蛋白表达阳性率下降(P<0.05)，而中低剂量党参干预组Bax蛋白表达变化不显著(图2F～J和表2).

2.4VEGF表达的变化

VEGF表达在肝细胞质中，与正常对照组比较，衰老模型组VEGF表达差异不显著(P>0.05)；与衰老模型组比较，党参高低剂量干预组VEGF表达增高(P<0.05)，中低剂量干预组VEGF表达变化不显著(P>0.05)，高剂量干预组VEGF表达明显优于中低剂量组(图3A～E和表3).

在小鼠脾脏中，与正常对照组比较，衰老模型组VEGF表达差异不显著(P>0.05)；与衰老模型组比较，党参高、中剂量干预组VEGF表达均有增高，党参高剂量组VEGF的表达变化显著(P<0.05)，低剂量干预组VEGF表达变化不显著(P>0.05)(图3F～J和表3).

图2　小鼠肝脏和脾脏Bax蛋白表达的变化

A～E:正常对照组、衰老模型组和低、中、高剂量党参干预组小鼠肝组织Bax蛋白的表达；F～J:正常对照组、衰老模型组和低、中、高剂量党参干预组小鼠脾组织Bax蛋白的表达；标尺=100μm.

A～E:TheexpressionofBaxproteininthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofBaxinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表2　Bax蛋白在小鼠肝脏和脾脏组织表达的平均光密度值

注：与正常对照比较，*P<0.05;与衰老模型组比较，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup,*P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

图3　小鼠肝脏和脾脏VEGF的表达变化

A～E:正常对照组、衰老模型组和低、中、高剂量党参干预组小鼠肝组织VEGF的表达；F～J:正常对照组、衰老模型组和低、中、高剂量党参干预组小鼠脾组织VEGF的表达；标尺=100μm.

A～E:TheexpressionofVEGFinthelivertissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;F～J:TheexpressionofVEGFinthespleentissueofnormalcontrolgroup,aginggroup,lowdoseofCPPSinverventionalgroup,middledoseofCPPSinverventionalgroup,andhighdoseofCPPSinverventionalgroup;Bar=100μm.

表3　VEGF蛋白在小鼠肝脏和脾脏组织表达的平均光密度值

注：与正常对照组比较，*P<0.05;与衰老模型组比较，ΔP<0.05.

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup, *P<0.05;Comparedwithagingmodelgroup,ΔP<0.05.

3　讨论

人体衰老，以五脏变化为先.在本研究中，衰老模型组小鼠肝、脾脏器指数和组织学切片与正常小鼠相比均发生了明显变化.其中肝细胞变得肿胀、胞浆疏松，脾小梁增生明显.作为人体内的重要器官，其组织大小结构的异常改变必然导致其功能的下降.而研究发现，当给予党参水提物干预后，组织大小和结构均有所改善，说明药物对衰老模型的组织损伤有一定的修复作用.

凋亡蛋白Bax的表达量增多，一方面直接促进细胞凋亡，另一方面可抑制原癌基因BCL-2的表达，间接促进细胞凋亡，在多种衰老组织中均发现其异常表达[5].本研究发现在D-半乳糖致衰老过程中，肝和脾组织Bax蛋白的表达都有明显增加.Lee等人发现随着大鼠年龄的增加，其肾组织Bax蛋白阳性细胞也不断增多[6].此外，在睾丸、脑和卵巢等组织中随着动物模型的衰老，Bax蛋白的表达都明显增加[7-9].本研究证实高浓度党参可以干预衰老模型肝脾组织Bax蛋白的表达及通过抑制细胞凋亡起到抗衰老作用，这一结果进一步证实了我们前期在分子水平研究党参抗衰老作用机制的发现[10].

血管形成是一个复杂的过程,受多种因子的正负调控，VEGF是其中作用最强的正调控因子之一，它通过其特异性受体-血管内皮生长因子受体结合刺激新生血管的形成[11].很多研究证实在机体衰老过程中，大部分组织中的血管生成会受到抑制[12-13].本研究证实在D-半乳糖致衰老模型肝组织中VEGF的表达明显低于正常肝组织.而高剂量党参可以干预此过程，VEGF的表达比衰老组织有明显增加.因此，促进血管生成是党参抗衰老作用的机制之一.

肝脾相关是中医学五脏相关理论的重要组成，《素问》中提到“肝生筋,筋生心，心生血,血生脾”，肝脾在生理、病理上息息相关[14].本研究发现肝脾两脏器的组织病理和分子表达在各实验组中都有明显的一致性.衰老组小鼠肝脾组织中VEGF表达下降，而Bax蛋白表达却增加，高剂量党参干预组这一表达关系又被逆转.有研究报道衰老所致VEGF的减少会使肾小管上皮细胞的增殖和抗凋亡能力减弱，促凋亡蛋白表达的增加，从而促进肾脏的凋亡[15].这说明在衰老肝脾组织中血管生成的抑制与促凋亡蛋白的表达也有密切联系，是抗衰老作用的潜在靶点之一.

综上所述，党参水提物对D-半乳糖致衰老模型组小鼠的肝脾组织具有一定的保护作用，其作用机制与调节血管生成，抑制促凋亡蛋白生成有关.因此，VEGF通路和Bax蛋白促凋亡因子将是党参抗衰老治疗的研究靶点.

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(责任编辑俞诗源)

Effects of the aqueous extract of Codonopsis pilosulaonthehistolomorphstructureandtheexpressionofBaxandVEGFinliverandspleenofagingmouseinducedbyD-galactose

WANG Jing,WANG Yong,LI Hai-long,YANG Ya-li

(School of Midical Laboratory,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China)

To investigate the effects of Codonopsis pilosula(CPPS) on the liver and spleen histolomorph structure and the expression of Bax and VEGF in liver and spleen of mouse induced by D-galactose,100 mouse(Kunming) are divided into normal control group,aging model group and low/middle/high dose of CPPS inerventional groups randomly.After treatment for 42 days,the changes of the liver coefficient and spleen coefficient are recorded,the morphologic changes of these tissues are observed,and the changes in the expression of Bax and VEGF in liver and spleen are also determined by immunohistochemical method.Results show that the liver coefficient and spleen coefficient of aging model group are significantly decreased(P<0.05),and markedly swelled,surface is rough and presenting bright red.The positive expression of Bax protein is increased significantly in liver and spleen of aging model group,while positive expression of VEGF protein is decreased significantly(P<0.05).Compared with aging model group,the organ coefficients in the high dose of CPPS interventional group are significantly increased(P<0.05),the liver swollen is significantly mitigated,and surface is smooth.The positive expression of Bax protein is decreased significantly in liver and spleen of high dose of CPPS interventional group,while the positive expression of VEGF protein is increased significantly(P<0.05).All results indicate that CPPS can stabilize the histolomorph structure,inhibit the excessive apoptosis of cells,and promote angiogenesis,which can protect the liver and spleen of aging mouse induced effectively.

Codonopsis pilosula;aging;tissuehistolomorph;Bax;VEGF

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.04.016

2016-03-03;修改稿收到日期:2016-04-12

甘肃省高等学校科研项目(2013A-087)；甘肃中医药大学青年教师科研基金资助项目(ZQ2015-20)

王晶(1982—)，女，甘肃天水人，副教授，博士.主要研究方向为利用生物芯片进行药物的筛选、疾病机理研究.E-mail:252993594@qq.com

*通讯联系人，男，副教授.主要研究方向为病理法医解剖学.E-mail:99773960@qq.com

R339.38

A

1001-988Ⅹ(2016)04-0072-06