改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

余婧婷， 孟焕新， 刘凯宁

(北京大学口腔医学院·口腔医院1.牙周科，2.综合科　口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室　口腔数字医学北京市重点实验室, 北京　100081)



·技术方法·

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

余婧婷1,2， 孟焕新1△， 刘凯宁1

(北京大学口腔医学院·口腔医院1.牙周科，2.综合科口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室口腔数字医学北京市重点实验室, 北京100081)

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法，为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源，对原有的原代培养方法进行了改良，期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人，取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养，培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5g/LDispaseⅡ酶(Ⅱ型分离酶)浸泡组织块过夜，将上皮与结缔组织分离，再用0.025%(质量分数)不含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10min，不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞，不仅降低了酶的消化浓度，减少了消化时间，还简化了重悬细胞的过程；组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程，在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定，并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞，成功率达88.9%，且细胞成片状生长，10～14d后可传代，传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡，而组织块法原代培养成功率虽然相同，但时间更长，17～22d后才可传代。经免疫细胞化学染色，角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代，可作为细胞学研究的稳定细胞来源。

牙龈；上皮细胞；原代细胞培养

牙龈上皮作为牙周组织的第一道屏障，在抵御牙周炎细菌入侵的过程中发挥了重要作用，建立正常人牙龈上皮细胞体外培养体系，将为各种牙龈上皮相关的研究提供稳定的实验模型。目前人牙龈上皮细胞的体外培养方法主要有3种，即滋养层细胞培养法、酶消化法和组织块法，其中滋养层细胞培养法易引入滋养层细胞DNA从而干扰实验[1]，而组织块法贴壁时所用的含血清培养基含有高浓度的钙离子会诱导上皮细胞分化，形成角化物，从而抑制上皮细胞分裂和增殖，使得上皮细胞生长较慢[2-4]，酶消化法可以获得较为单纯优良的细胞，但因为各种酶的消化时间过长导致细胞存活率不高(仅为11.8%)[5]。本研究拟寻求一种成功率较高的人牙龈上皮细胞原代培养方法，同时较快获得单一体系的牙龈上皮细胞，为进行牙龈上皮的细胞学研究提供稳定的细胞来源。

1　资料与方法

1.1研究对象

本研究选取在北京大学口腔医院牙周科就诊并行“冠延长术”的牙周相对健康患者为研究对象。牙周相对健康定义为术区牙周探诊深度不超过4mm，牙龈色粉红，无红肿或仅有轻度水肿，探诊出血指数0～2。本研究开始前经过北京大学口腔医院伦理委员会审查批准，符合医学伦理学要求，所有参与研究的患者均签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1牙龈上皮细胞的原代培养经患者书面知情同意后，取冠延长术中切取下来的“领圈”牙龈组织，立即放入含3～4倍双抗的D-Hank’s液(平衡盐溶液)中37 ℃约1h。酶消化法：传统的酶消化法如Oda等[5]所述，将牙龈组织置于4g/LDispaseⅡ酶(Ⅱ型分离酶)1mL中37 ℃ 4h，上皮与结缔组织可轻松用镊子分离，将上皮剪成约0.5mm3碎块，置于0.05%(质量分数)含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰蛋白酶2mL中摇床振荡消化30min，至消化物成絮。加入含10%(体积分数)血清的DMEM培养基2mL中止消化，700r/min离心5min，弃去上清及组织块，加适量无血清培养基再次重悬细胞沉淀并计数，以5×105/mL细胞密度接种于六孔板或6cm细胞培养皿中，每2天换液1次。本课题组对上述传统方法进行了改良：将牙龈组织置于2.5g/LDispaseⅡ酶(美国Sigma公司)中4 ℃过夜(约8h)，上皮与结缔组织分离剪碎后，置于0.025%(质量分数)不含EDTA的胰蛋白酶(美国Amresco公司1 ∶250胰蛋白酶配制)2mL中轻轻摇晃混匀，静置消化10min， 加入含10%(体积分数)血清DMEM培养基(美国Gibco公司)中止消化，1 000r/min离心5min并弃去上清液，保留组织块，加适量DefinedK-SFM含添加物无血清培养基(美国Gibco公司)重悬组织块及细胞沉淀并计数接种，每2天换液1次。组织块法[6]：剪去所有结缔组织，将剩余上皮组织剪碎成的0.5mm3碎块，平铺于60mL细胞培养瓶底，块与块之间均匀间隔5mm。将培养瓶翻转，加入含10%(体积分数)血清的DMEM培养基，倒置于37 ℃ 5%(体积分数)CO2培养箱中2h。待组织贴壁后，再次缓慢翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中而不移动。3d后观察，若牙龈上皮细胞从组织块爬出并贴壁于瓶底，视为细胞生长状态，7d后弃去培养基，组织块可随换液弃去，D-Hank’s液冲洗3遍，加入DefinedK-SFM无血清培养基(含添加物)，每2天换液1次。

1.2.2牙龈上皮细胞的传代培养原代牙龈上皮细胞生长至铺满瓶底80%后，此时处于对数生长期，可开始传代。弃去培养液，用0.25%(质量分数)含EDTA胰蛋白酶(美国Gibco公司)消化细胞，置于37 ℃ 5%(体积分数)CO2培养箱孵育3～5min，至细胞缩为圆形但仍贴壁，加入含10%(体积分数)血清的培养基DMEM中止消化，吹打细胞制成悬液，1 000r/min离心5min，弃去上清，加适量DefinedK-SFM无血清培养基(含添加物)重悬细胞沉淀并计数接种于新的培养皿或培养瓶中。

1.2.3牙龈上皮细胞的免疫细胞化学鉴定将消化后的牙龈上皮细胞接种于玻璃爬片上，培养24h后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，经丙酮固定，0.1%(体积分数) 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)渗透，3%(体积分数) 过氧化氢(H2O2)处理，血清封闭后加入鼠抗人角蛋白单克隆抗体AE1/AE3(北京中杉金桥公司)，4 ℃过夜，PBS冲洗后再依次加入生物素标记的二抗(体积比1 ∶50稀释)、辣根酶标记的链霉卵白素，室温各孵育30min，DAB显色，镜下观察，苏木素复染，封片。

2　结果

2.1研究对象基本信息

纳入本研究的患者共9人，年龄28～35岁，其中男性4人，女性5人(表1)。

利用改良酶消化法和组织块法分别培养原代牙龈上皮细胞，除4号患者外，两种方法均成功培养出牙龈上皮细胞，成功率为88.9%。

表1　纳入研究的9名患者临床资料

2.2牙龈上皮细胞的原代培养

传统的酶消化法由于各种酶的作用时间和浓度较高，导致原代细胞培养成功率不高，本课题组对该方法进行了一定改进(表2)，成功率明显提高。

表2　传统酶消化法与改良后酶消化法的区别

本课题组利用改进后的酶消化法培养的原代牙龈上皮细胞，镜下可见细胞长满80%以上(图1)：贴壁的牙龈上皮细胞如“荷包蛋”样，居中为圆形或椭圆形细胞核，透光性较差，周围为胞浆，边界不规则，透光性好。细胞分布均匀，融和成片，呈不规则多边形，细胞间接触紧密，呈典型的铺路石状。

组织块法培养的原代牙龈上皮细胞形态类似，但由于细胞是以组织块为中心向四周扩散生长，可见原组织块附近细胞较密集，周边细胞较分散，分布不均匀(图2)。

2.3牙龈上皮细胞的生长和传代

改良酶消化法培养的原代细胞贴壁10～14d后即长满培养皿底部的80%并传代，而组织块法培养时间较长，7d后牙龈上皮细胞才开始快速增殖，一般约17～22d才可传代。二者成功率近似，除4号患者外其余均成功培养出牙龈上皮细胞，成功率为88.9%。

细胞传代发现两种方法培养的牙龈上皮细胞贴壁都较紧密，仅能消化30%的原代细胞。传至二代上皮细胞形态均无明显变化，但三代以后细胞开始逐渐生长缓慢，分化出现体积较大、形态不规则的“巨细胞”(图3)，随着培养时间的延长数量不断增加，胞浆内出现空泡和黑色颗粒，最终细胞逐渐凋亡。

改良酶消化法与组织块法的比较见表3。

2.4细胞鉴定

免疫细胞化学染色结果显示，鼠抗人角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色阳性，胞浆棕黄色，核染色为阴性，经苏木素复染后呈蓝色(图4)，证明原代培养细胞为人牙龈上皮细胞。

A, ×10; B, ×20.
图1患者8牙龈原代上皮细胞
Figure 1Primary gingival epithelial cells of patient case 8

图2组织块法培养原代上皮细胞分布不均匀，组织块附近细胞密集，周边细胞分散
Figure 2The cells cultured by the tissue explant method distribute unequally, with more cells concentrated around the tissue piece, and less cells peripherally

图3巨细胞形态不规则，体积较大，胞浆内出现空泡
Figure 3Giant cells are irregular, larger, with vacuoles in the cellular plasma

图4免疫细胞化学鉴定角蛋白染色阳性
Figure 4Indirect immunocytochemical staining of cells, with positive cytokeratin staining

3　讨论

本研究对经典的牙龈上皮细胞原代培养方法(酶消化法)的过程进行了改进，比较了该改进的方法与传统的组织块法这两种方法的成功率和生长时间，发现酶消化法可以更加快速地培养出原代牙龈上皮细胞，平均约10～14d即可传代，而组织块法需要17～22d才可传代，二者均未见牙龈成纤维细胞混杂，成功率都较高，可达88.9%，其中4号患者可能由于年龄较大，未能培养出原代牙龈上皮细胞。经免疫细胞化学染色鉴定，角蛋白染色呈阳性，说明原代培养出的细胞均为牙龈上皮细胞。

酶消化法在培养原代牙龈上皮细胞时具有一定的局限性，主要是由于各种消化酶的工作浓度和作用时间存在差异，很容易造成细胞消化过度导致细胞死亡，本研究对消化方法[5]进行了一定的改进。DispaseⅡ酶是作用于上皮及结缔组织间连接基质的一种蛋白酶，虽然作用温和，但在37 ℃的培养箱中若作用时间过短则上皮与结缔组织不易分离，作用时间过长会使细胞活性降低，较难控制准确的作用时间，所以采用4 ℃冰箱孵育过夜，且降低工作浓度[7-9]，作用更加温和，对细胞活性无明显影响，最终上皮与结缔组织能够轻松分离。胰蛋白酶在消化上皮碎片的过程中，以往方法采用的工作浓度(质量分数)为0.05%，改良法采用0.025%(质量分数)不含EDTA的胰蛋白酶，浓度较常用方法减半，轻轻摇晃混匀后直接静置于37 ℃的培养箱中，避免摇床振荡过程对细胞造成的损伤。消化完成后组织块与大量细胞粘连成絮状，故并未将组织块去除，而是改良为离心一次后将组织块与细胞一同重悬沉淀，这样既避免丢弃粘连于组织块上的细胞，又减少了二次离心对细胞造成的损伤。组织块在换液时即可丢弃，但培养出的原代牙龈上皮细胞仅能传至二代，三代以后细胞逐渐变形凋亡，所以传代消化的条件还需进一步摸索[10]。

表3　改良酶消化法和组织块法培养牙龈上皮细胞的比较

综上所述，本研究改良的酶消化法方法在DispaseⅡ酶和胰蛋白酶的浓度、作用时间和方式上均采取了一定改进，虽然消化后所得的细胞数量可能减少，但大大降低了酶消化过程对细胞活性的影响，同时对离心过程也进行了精简，从而保证了培养细胞最终的成活率得到提高。本实验采用的改良酶消化法克服了现有牙龈上皮细胞原代培养方法的缺点，不存在滋养层细胞的污染，不会有牙龈成纤维细胞的混杂，成功率较高，原代至传代培养时间短，二代以前都具有和原代细胞相似的形态，可以为牙龈上皮细胞的相关研究提供稳定、可靠的实验细胞来源。

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(2015-10-18收稿)

(本文编辑：王蕾)

Anmodifiedculturemethodofprimaryhumangingivalepithelialcells

YUJing-ting1,2,MENGHuan-xin1△,LIUKai-ning1

(1.DepartmentofPeriodontology, 2.DepartmentofGeneralDentistry,PekingUniversitySchoolandHospitalofStomato-logy&NationalEngineeringLaboratoryforDigitalandMaterialTechnologyofStomatology&BeijingKeyLaboratoryofDi-gitalStomatology,Beijing100081,China)

Objective：Toestablishastableprimaryculturemethodofhumangingivalepithelialcells,withahighersuccessfulrateandshorterculturetime.Methods:Ninepatientswhoreceived“crown-lengtheningsurgery”withrelativelyhealthyperiodontalconditionswereselected(n=9).Gingivalsampleswerecollectedfromthe9donorsduringgingivectomy.Gingivalepithelialcellswereisolatedandculturedbybothanadvancedenzymedigestionmethodandatissueexplantmethod.Intheadvancedenzymedigestioncultureprocess, 2.5g/LDispaseⅡwasusedtoseparatetheepithelialtissuepartfromtheconnectivetissuepart,whichlastedforonenight.Thentheepithelialtissuesweredigestedby0.025%trypsinwithoutEDTAfor10minutes,andcentrifugedbykeepingthedigestedepithelialtissuesthatremained.Thisadvancedmethodnotonlydecreasedtheconcentrationanddigestingtimeofthetwoabove-mentionedenzymes,butalsosimplifiedthecentrifugelprocess.Thetissueexplantmethodwasnotchangedtoomuchcomparedwiththeoriginalmethod.Growingprocessesoftheprimarycellsculturedbythetwomethodswereobservedandrecordedrespectively,andindirectimmunocytochemicalstainingwasusedtoidentifythetypeofculturedcells.Atthesametime,successfulratesandcellculturetimewerealsocomparedbetweenthetwomethods.Results:Humangingivalepithelialcellswithtypicalmorphologycouldbeculturedwithinashorterperiodbytheadvancedenzymedigestionmethodwithasuccessfulrateof88.9%,andproliferatedrapidlyassheets.After10-14dcellscouldbepassaged,graduallyturnedtobelikefibroblastswhenpassagedtothethirdgeneration,andeventuallywenttoapoptosis.Theprimaryculturetimewaslongerbyusingthetissueexplantmethod,andapproximatelyafter17-22dcellscouldbepassaged,althoughthesuccessfulratewasthesameastheenzymedigestionmethod.Cytokeratinstainingwasbothpositivebyindirectimmunocytochemicalstainingofcells.Conclusion:Primaryhumangingivalepithelialcellsculturedbytheadvancedenzymedigestionmethodcouldgrowfasterandbepassagedtothesecondgenerationsuccessfully,whichcouldsupplyastableoriginforcellularexperiments.

Gingiva；Epithelialcells;Primarycellculture

R781.4

A

1671-167X(2016)04-0733-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.033

△Correspondingauthor’se-mail,kqhxmeng@bjmu.edu.cn

网络出版时间：2015-7-413：17：57网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160704.1317.020.html