敲减CMTM3增强前列腺癌细胞系PC3迁移与侵袭能力

胡风战，原婉琼，王晓林，秦彩朋，盛正祚，杜依青，殷华奇，徐　涛△

(1. 北京大学人民医院泌尿外科， 北京　100044； 2. 北京大学人类疾病基因研究中心， 北京　100191)



·论著·

敲减CMTM3增强前列腺癌细胞系PC3迁移与侵袭能力

胡风战1，原婉琼2，王晓林2，秦彩朋1，盛正祚1，杜依青1，殷华奇1，徐涛1△

(1. 北京大学人民医院泌尿外科， 北京100044； 2. 北京大学人类疾病基因研究中心， 北京100191)

目的：应用慢病毒载体shRNA对PC3细胞中的人趋化素样因子超家族成员3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3，CMTM3)进行敲减，以探究CMTM3对前列腺癌细胞系生物学行为改变的影响。方法： 研究分为两组进行，其中shN为未敲减CMTM3的PC3细胞系对照组，sh393为敲减CMTM3的PC3细胞系实验组。运用Western blot检测PC3细胞系慢病毒shRNA敲减CMTM3后的表达，Transwell与细胞划痕实验检测敲减CMTM3对PC3细胞系迁移能力的影响，Matrigel实验检测敲减CMTM3对PC3细胞系侵袭能力的影响。结果： 前列腺癌细胞系PC3经慢病毒敲减CMTM3后，sh393组CMTM3表达水平明显低于shN组(0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7，P<0.001)， 且sh393组侵袭(248.6±4.5vs. 113.0± 3.3)、迁移(203.6±1.9vs. 103.0±1.2)及迁移愈合能力(95.0±2.9vs. 33.0±1.5)均明显强于shN组(P<0.001)。结论： 敲减CMTM3可以影响PC3细胞的迁移与侵袭能力，CMTM3下调与PC3细胞系肿瘤生物学特性的改变可能具有负相关性。

前列腺肿瘤；CMTM3；基因敲减技术；细胞迁移实验；体外研究

前列腺癌是男性常见的泌尿生殖系肿瘤之一，在我国发病率虽低于欧美[1-2]，但随着近年来经济发展和生活水平的提高，我国群众的饮食和生活方式逐渐与西方接近，尤其是伴随着人口老龄化的来临，前列腺癌的发病率及病死率均出现较大程度地增加[3-4]，因此，加强对前列腺癌这一危害男性健康的恶性疾病的研究与治疗刻不容缓[5-6]。

前列腺癌的发生、发展及其向去势抵抗转变的分子机制仍不清楚[7-8]，目前肿瘤免疫相关研究证实，前列腺癌的发生、发展可能与四跨膜蛋白超家族(transmembrane-4 superfamily，TM4SF)密切相关，TM4SF包括MARVEL结构域，与细胞的增殖、分化密切相关，在消化系统肿瘤中发挥重要作用[9-10]。CKLF样MARVEL穿膜结构域超家族3(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3，CMTM3)是人趋化素样因子超家族(chemokine-like factor super family member，CKLFSF)的一员，具有典型的四跨膜受体TM4SF结构，研究显示其作为肿瘤抑制性基因具有潜在的靶向治疗研究价值[11-13]。CMTM3在进化过程中高度保守，广泛表达于人类正常组织，尤其在睾丸、脾、白细胞中高度表达，但在大多数肿瘤细胞系和组织中表达下调或不表达，恢复其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、粘附和迁移等生物学行为。有研究显示，CMTM3的表达水平与前列腺癌的分级、分期具有间接的负相关关系[14]，在前列腺癌LNCaP细胞系中CMTM3与雄激素受体表达关系密切[15]，本研究拟对CMTM3在前列腺癌细胞系PC3中的作用做初步探讨。

1　材料与方法

1.1材料

本研究所用兔抗人CMTM3多克隆抗体由北京大学人类疾病基因组中心提供，靶向沉默人CMTM3基因位点的pGIPZ慢病毒shRNA微载体(sh393组)与无CMTM3基因位点沉默的pGIPZ慢病毒载体(shN组)由Thermo Fisher Scientific公司Open Biosystems合成。改良型RPMI-1640培养基和胰蛋白酶购自美国Hyclone公司，胎牛血清、100×青霉素链霉素双抗、100×L-谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]等均购自美国Life Technology公司，前列腺癌细胞系PC3购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)， Transwell和Matrigel小室等购自美国BD公司。

1.2细胞培养

骨转移灶来源前列腺癌细胞系PC3采用RPMI-1640培养基加10%(体积分数)胎牛血清(fetal calf serum，FBS)、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素以及1%(体积分数)HEPES缓冲液进行培养。

1.3免疫印迹试验(Western blot)

将培养细胞弃去培养基，冰磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗2遍后加入RIPA裂解液，提取蛋白质。取等量蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)后，将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维膜上；3%(质量分数)脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜；三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(triethanolamine buffered saline solution-Tween，TBS-T)洗膜后加入二抗(GAPDH抗体不加), 室温1 h，TBS-T洗膜后增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)，Gel Doc XR凝胶成像系统显影，分析结果并拍照。

1.4Transwell与Matrigel实验

实验开始前先将两组PC3细胞于无血清RPMI-1640培养基过夜培养。第2天，将含有1×105(Matrigel实验)或5×104(Transwell实验)个细胞的无血清RPMI-1640培养基接种到上室，小室下壁未覆盖Matrigel(Transwell实验)或覆盖Matrigel(Matrigel实验)，下室加入0.5 mL含有10%FBS的RPMI-1640培养基，于37 ℃孵育，合适时间点后取出上室，4%(体积分数)多聚甲醛固定10 min，2%(体积分数)结晶紫染色10 min，100倍显微镜下计数并拍照。

1.5细胞划痕实验

实验进行时将PC3细胞培养于2%FBS的RPMI-1640培养基，以期最大限度减少增殖对细胞迁移愈合能力的影响，先用记号笔在6孔板背后，用直尺均匀地划横线，大约每隔0.5～1.0 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线，在孔中加入约0.5×105个细胞，接种原则为过夜后融合率达到100%。第2天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37 ℃ 5%(体积分数)CO2培养箱培养。可在0、6、12、24 h时间点取样并拍照，具体时间依实验需要而定，使用Image J软件打开图片，随机划取6～8条水平线，计算细胞间距离的均值。

1.6统计学分析

所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行分析，肿瘤生物学行为实验结果以均数±标准误表示，实验重复3次，使用t检验分析各组之间的差异是否具有统计学意义。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CMTM3在前列腺癌细胞系PC3中的表达水平

Western blot实验表明，sh393组CMTM3表达水平明显低于shN组(0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7，P<0.001，图1)。

图1敲减CMTM3后的PC3细胞系中CMTM3的表达水平
Figure 1The expression of CMTM3 after knockdown of CMTM3 in PC3 cell

2.2敲减CMTM3后PC3细胞系侵袭能力增强

Matrigel实验表明，sh393组侵袭能力明显强于shN组(248.6±4.5vs. 113.0± 3.3，P<0.001，图2A)。

2.3敲减CMTM3后PC3细胞系迁移能力明显增强

Transwell实验显示，sh393组迁移能力明显强于shN组(203.6±1.9vs. 103.0±1.2，P<0.001，图2B)。

2.4敲减CMTM3后PC3细胞系相对迁移愈合能力明显增强

细胞划痕实验结果显示，sh393组相对迁移愈合能力明显强于shN组(95.0±2.9vs. 33.0±1.5，P<0.001，图3)。

图2敲减CMTM3后PC3细胞系侵袭(A)和迁移(B)能力增强
Figure 2Knockdown of CMTM3 promotes invasion(A) and migration(B) of PC3 cell

3　讨论

本研究结合已有的关于CMTM3在前列腺癌中的研究报道，进一步丰富了CMTM3在前列腺癌细胞系肿瘤生物学行为方面的研究内容，对于趋化素样因子在人类前列腺癌肿瘤基因治疗方面的作用有了进一步的了解。

在染色体定位上，CKLF和CMTM1～4定位于16q22.1，CMTM6～8定位于3p22.3，形成两个基因簇，而CMTM3位于16q22.1，该位点与多种肿瘤的发病机制相关，而且此前研究已证实CMTM3具有肿瘤抑制基因作用[16]。CMTM3在人体正常组织中呈广谱表达，且位于人类染色体16q22.1上的CMTM3基因缺失、甲基化等表观遗传学的改变可以导致肿瘤的发生。对于其在多种不同来源的肿瘤组织和相应细胞系(如胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、肾癌与睾丸癌)中的表达谱分析发现，CMTM3表达水平较对照组表达下调或者缺如，应用腺病毒或其他载体系统过表达CMTM3基因可以对肿瘤细胞系的迁移、侵袭、增殖能力产生影响，且在不同组织来源的肿瘤细胞系其效果不同，而选择性下调CMTM3表达对肿瘤细胞系的迁移、侵袭能力等肿瘤恶性程度指标具有增强作用。在这些肿瘤，尤其是前列腺癌中，CMTM3作为潜在的抑癌基因具有治疗靶点的应用价值。

CMTM3在前列腺癌及其细胞系(PC3、LNCaP)中的作用尚不明确，本课题组发表的文章阐释了CMTM3的表达水平与前列腺癌组织病理分期、分级的负相关关系，同时应用低表达CMTM3的LNCaP细胞系进行腺病毒感染过表达CMTM3，从恢复CMTM3表达的角度验证了CMTM3对前列腺癌肿瘤生物学行为的抑制作用[17-20]。恢复CMTM3表达不仅可在体外抑制前列腺癌PC3细胞的增殖与迁移，还可在体内抑制裸鼠移植瘤的生长。本研究对前期实验结果进行了补充和完善，通过对骨转移灶来源的前列腺癌细胞系PC3的慢病毒shRNA沉默以及进一步的肿瘤生物学迁移、侵袭等相关功能实验，表明CMTM3对前列腺癌细胞系的迁移和侵袭能力具有明显的抑制作用，提示CMTM3可能在前列腺癌的发生、发展中发挥重要作用。

图3敲减CMTM3后PC3细胞系相对迁移愈合能力增强
Figure 3Knockdown of CMTM3 promotes relative migration ability of PC3 cell

前期实验已经发现CMTM家族成员中的CMTM5、CMTM7和CMTM8 均可通过调节表皮生长因子受体而抑制下游信号分子的活化，发挥抑制肿瘤细胞的作用[21-23]，但本文并未对CMTM3在前列腺癌的相关作用机制进行研究,这是本研究的不足之处。

综上，CMTM3的表达缺失可能参与了前列腺癌的发生、发展，尤其是前列腺癌骨转移的发生，CMTM3对前列腺癌进展及向激素非依赖状态和骨转移发生的转变所起到的作用，还有待进一步深入研究。

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(2016-03-09收稿)

(本文编辑：赵波)

Knockdown of CMTM3 promotes migration and invasion of PC3 cellinvitro

HU Feng-zhan1, YUAN Wan-qiong2, WANG Xiao-lin2, QIN Cai-peng1, SHENG Zheng-zuo1, DU Yi-qing1, YIN Hua-qi1, XU Tao1△

(1. Department of Urology, Peking University People’ s Hospital, Beijing 100044, China; 2．Peking University Center for Human Disease Genomics,Beijing 100191, China)

Objective：To investigate the change of biological characteristics after stable knockdown of CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3 (CMTM3) expression in PC3 by lentivirus shRNA and to reveal new therapeutic targets. Methods: The research includes two groups: sh393 is the experimental group in whichCMTM3 is knocked down in PC3 cell line; shN is the control group in whichCMTM3 is negatively knocked down. The expression ofCMTM3 was detected by Western blot. The migration ability of PC3 after stable knockdown was detected by Transwell and Wound healing assay. The invasion ability of PC3 was detected by Matrigel assay. Results were obtained from at least three indivi-dual experiments. Results: The expression ofCMTM3 in sh393 group is significant lower than shN group (0.004 0±0.000 4vs. 0.490 0±0.055 7,P<0.001) detected by Western blot. It also had statistical significance in Matrigel assays (248.6±4.5vs. 113.0± 3.3), Transwell (203.6±1.9vs. 103.0±1.2) and Wound healing assays (95.0±2.9vs. 33.0±1.5) that knockdown ofCMTM3 promoted migration, and invasion of PC3 cellsinvitro(P<0.001). Conclusion: Negative correlation exists between the stable knockdown ofCMTM3 and change of biological characteristics in PC3 cells, and knocking downCMTM3 affects migration, and invasion ability in PC3 cells.

Prostatic neoplasms;CMTM3; Gene knockdown techniques; Cell migration assays;Invitro

国家自然科学基金(81072099)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81072099)

R737.25

A

1671-167X(2016)04-0594-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.005

△ Corresponding author’s e-mail,xutao@medmail.com.cn

网络出版时间：2016-6-2914:18:36网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160629.1418.020.html