趋化因子配体19在类风湿关节炎患者血清中的表达及临床意义

石连杰，李建红，胡凡磊，李　敏，张　杰，李江涛，栗占国△

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 北京　100044； 2. 四川大学华西医院核医学科， 成都　610041； 3. 四川省骨科医院风湿科， 成都　610041； 4. 宜宾市第一医院风湿科， 四川宜宾　644000)



·论著·

趋化因子配体19在类风湿关节炎患者血清中的表达及临床意义

石连杰1，李建红2，胡凡磊1，李敏3，张杰4，李江涛4，栗占国1△

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 北京100044； 2. 四川大学华西医院核医学科， 成都610041； 3. 四川省骨科医院风湿科， 成都610041； 4. 宜宾市第一医院风湿科， 四川宜宾644000)

目的：探讨趋化因子配体19(C-Cchemokineligand19，CCL19)在类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)患者血清中的表达水平及临床意义。方法：采用酶联免疫吸附测定检测RA患者和健康对照血清CCL19的表达水平，收集患者临床及实验室资料，利用流式细胞术检测患者外周血B细胞及记忆B细胞亚群的比例。对比不同临床特征的RA患者血清CCL19表达差异，分析血清CCL19水平与临床及实验室指标、B细胞及记忆B细胞亚群间的相关性。数据分析采用独立样本t检验、配对t检验、Pearson和Spearman相关分析。结果：RA患者血清中高表达CCL19(P<0.001)，治疗后的RA患者CCL19表达显著降低(P<0.001)。CCL19与红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrate，ESR)、C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)、28个关节的疾病活动度评分(diseaseactivityscorein28joints，DAS28)无相关性(P>0.05)，但与类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)、抗环瓜氨酸多肽(cycliccitrullinatedpeptide，CCP)抗体水平显著相关(r=0.42，P=0.002；r=0.33，P=0.013)；CCL19水平在抗CCP抗体阳性组显著高于抗CCP抗体阴性组，RF阳性组显著高于RF阴性组，高、低疾病活动组间以及早期和非早期RA组间差异均无统计学意义；CCL19与外周血CD19+、CD27+、D27-、CD27+IgD+、CD27+IgD-、CD27-IgD+、CD27-IgD-B细胞的比例均未见显著相关性(P>0.05)。相较于健康对照，RA患者外周血CD27+IgD+、CD27+IgD-、CD27+B细胞比例均显著减少。结论：血清CCL19水平可以反映RA患者的免疫活动状态，可预判RA患者B细胞抗体分泌的功能状态，从而可能指导RA临床治疗策略的选择。

关节炎， 类风湿；趋化因子CCL19；类风湿因子；抗体；B淋巴细胞

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种常见的自身免疫性疾病，发病机制不甚清楚。多数RA患者体内存在大量自身抗体，包括类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)、抗环瓜氨酸多肽(cycliccitrullinatedpeptide，CCP)抗体及抗角蛋白抗体(anti-keratinantibody，AKA)等，这些抗体滴度的高低在临床上常作为判断RA预后的指标之一[1]。自身抗体由B细胞分泌产生，而且B细胞还具有分泌促炎因子、递呈抗原等功能[2]。因此，B细胞在RA致病中的作用受到越来越多的关注，特别是抗CD20单抗(利妥昔)用于治疗RA后取得了巨大的成功，进一步肯定了B细胞在RA致病中的重要作用[3-4]。

趋化因子配体19(C-Cchemokineligand19，CCL19)是一个重要的趋化因子，通过结合趋化因子受体7(C-Cchemokinereceptor7，CCR7)发挥包括趋化作用在内的一系列生物功能。分泌抗体的B细胞是表达CCR7的主要细胞之一，最新研究发现调控B细胞抗体产生的滤泡辅助性T(follicularBhelperT，Tfh)细胞也表达该分子，且是Tfh细胞表面标记之一[5-6]。Comerford等[7]曾报道RA患者血清中CCL19表达增高，但高表达的CCL19是否与RA病情活动相关，是否与外周血B细胞亚群的数量及功能相关，CCL19能否作为血清分子标记预判RA患者疾病特点并指导临床治疗，国内外尚无报道。因此，本研究拟通过分析RA患者中CCL19的表达及其与RA临床指标、B细胞及相关亚群的关系，明确CCL19在RA诊治中的临床意义，以指导临床医师在RA治疗过程中制定精准的治疗方案。

1　资料与方法

1.1研究对象

选取病情活动期RA患者70例，其中女性62例，男性8例，年龄在22～70岁，平均年龄(46±11)岁；选取健康对照(healthycontrols，HC)30例，其中女性25例，男性5例，年龄在24～56岁，平均年龄(39±15)岁。收集所有研究对象的血清样品，同时收集RA患者中30例的EDTA抗凝全血100μL，并于治疗6个月后再次采集血清。RA诊断符合1987年美国风湿病学会修订的RA分类标准[8]。

1.2主要试剂及仪器

CCL19Duo-set酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)试剂盒购自美国R&D公司，小鼠抗人CD19-APC-Cy7、IgD-FITC及CD27-APC流式抗体购自美国Biolegend公司，红细胞裂解液购自美国BD公司。酶标仪购自美国Bio-Rad公司，BDFACSAriaⅡ流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3血清CCL19的检测

将收集的血清以1 ∶10进行稀释，采用ELISA方法检测其中CCL19的含量。

1.4外周血B细胞及其亚群的检测

采集新鲜的EDTA抗凝血，加入CD19-APC-Cy7、IgD-FITC及CD27-APC流式抗体各5mL，4 ℃混匀，避光孵育30min；加入2mLl×裂红液室温避光孵育10min，1 500r/min离心5min，弃去上清；再将细胞沉淀用磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，PBS)洗涤两遍，弃去上清；最终以200μLPBS重悬上机检测。检测过程中，先以淋巴细胞群设门，计算出CD19+B细胞占淋巴细胞的比例；再以CD19+B细胞设门，计算CD27+IgD+、CD27+IgD-、CD27-IgD+、CD27-IgD-、CD27+、CD27-B细胞占B细胞的比例。

1.5临床数据的采集

评估RA患者留取样本当时的关节肿胀及压痛数目，并记录患者当时的实验室相关检查结果，包括红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrate，ESR)、C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)、血常规、抗CCP抗体滴度、类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)滴度等资料。

1.6疾病活动度评估

1.7统计学处理

采用SPSS17.0软件对数据进行分析。两组间的比较采用独立样本t检验，治疗前后的对比采用配对t检验；相关性分析根据数据是否符合正态分布，分别采用Pearson和Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CCL19在RA患者血清中的表达

ELISA检测结果显示，RA患者血清CCL19表达显著高于健康对照组[(863.49 ± 825.09)ng/Lvs. (157.80 ± 125.2)ng/L，P<0.001，图1]。

RA,rheumatoid arthritis; HC, healthy controls.
图1RA患者(n=70)和HC(n=31)血清CCL19表达
Figure 1Serum CCL19 levels in RA patients (n=70) and HC (n=31)

2.2RA患者治疗前后CCL19的表达差异

收集30例接受传统抗风湿药物治疗6个月的RA患者治疗前后的血清样品，该30例患者在治疗后病情出现不同程度改善，其中18例病情达到低疾病活动度状态，ELISA检测该18例治疗前后血清CCL19水平，治疗后RA血清CCL19水平显著低于治疗前[(540.42 ± 289.89)ng/Lvs. (722.2 ± 344.44)ng/L，P<0.05，图2]。

图2RA患者治疗前后CCL19水平(n=18)
Figure 2Serum CCL19 levels decreased in RA patients after treatment (n=18)

2.3CCL19与临床指标的相关性分析

相关分析显示，血清CCL19水平与RF、抗CCP抗体滴度显著相关(图3)，与ESR、CRP、血小板、关节肿胀数、关节压痛数及疾病活动度无明显相关性。

2.4不同临床特征RA患者CCL19表达差异分析

为了分析CCL19在不同临床特征RA患者中的分布特点，本研究进一步对比了RF阳性和阴性、抗CCP抗体阳性与阴性、早期(病程<2年)和非早期、HDA和LDA的RA患者血清CCL19表达差异。结果如图4所示，RA患者血清CCL19表达在RF阳性组显著高于RF阴性组，抗CCP抗体阳性组显著高于抗CCP抗体阴性组，但早期与非早期、HDA与LDA的RA患者间CCL19的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

RF, rheumatoid factor; CCP, cyclic citrullinated peptide.
图3CCL19与RF、抗CCP抗体滴度显著相关
Figure 3Serum CCL19 levels correlated with the titers of RF and anti-CCP antibody

2.5CCL19与B细胞及记忆B细胞亚群的相关分析

采用流式细胞术测定20例RA患者的外周血B细胞及CD27+IgD+、CD27+IgD-、CD27-IgD+、CD27-IgD-、CD27+、CD27-B细胞比例，同时留取该20例患者的血清检测CCL19水平，并进行相关分析，研究发现血清CCL19水平与外周血总B细胞比例及上述记忆B细胞亚群比例无显著相关性(表1)。

表1　 CCL19与B细胞及及记忆B细胞亚群的相关性分析

2.6RA患者CD27+B细胞亚群数量均低于健康对照

为了证实导致RA血清中CCL19水平增高的原因并非取决于B细胞数量，而是B细胞的功能状态，本研究收集30例健康对照外周血，测量上述各记忆B细胞亚群占CD19+B细胞的比例，并与RA患者进行对比。图5A代表1例RA和1例健康对照的CD27+记忆B细胞亚群分布，以CD19+B细胞设门，健康对照外周血CD27+的各记忆B细胞亚群均高于RA(图5B)。

RF, rheumatoid factor; ACPA, anti-cyclic citrullinated peptide antibody; ERA, early rheumatoid arthritis; RA, rheumatoid arthritis; HDA, high di-sease activity; LDA, low disease activity.
图4不同临床特征RA患者CCL19表达差异
Figure 4Serum CCL19 levels in RA patients with different characteristics

A, images shown are representative of sixty separate tests on blood samples including 30 healthy controls and 30 RA patients; B, the numerical diffe-rences of CD27 B cell subsets in peripheral blood between healthy controls and RA patients. HC, health controls; RA, rheumatoid arthritis.
图5HC(n=30)和RA患者(n=30)外周血中记忆B细胞亚群表达差异
Figure 5Peripheral blood memory B cell subsets in HC (n=30) and RA patients (n=30)

3　讨论

近年来，B细胞在RA中的致病机制受到广泛关注，临床上，利用抗CD20单抗通过清除体内B细胞治疗RA已取得满意疗效，进一步证实了B细胞在RA的发生、发展中发挥着重要作用。然而，并非所有的RA患者对这一治疗反应均良好，我们猜测可能存在一类以B细胞为主要致病细胞的RA，因此，寻找一个能预判RA疾病类型的分子将有助于指导RA的临床治疗。

CCL19、CXCL12和CXCL13均是B细胞的趋化因子，国内外大量研究报道了CXCL12、CXCL13与RA的关系。近年来，虽偶有RA中CCL19表达的相关报道，但缺乏CCL19和记忆B细胞亚群数量及功能关系的研究报道[9-12]。本研究首先对比了RA患者和HC人群外周血清中CCL19的表达水平，结果提示RA患者CCL19表达水平显著高于HC人群，这与先前Sellam等[13]报道相一致。在此基础上，为了明确CCL19在RA中可能的临床意义，本研究纳入了30例处于中、高疾病活动状态的RA患者，通过调整治疗方案，对其进行为期6个月的随访，其中18例患者在6个月后病情活动度明显下降，该部分患者治疗后血清CCL19水平显著下降，提示CCL19水平可能和RA疾病活动有关联。

进一步的相关分析发现，CCL19与RF、抗CCP抗体滴度显著相关，而与ESR、CRP及DAS28等指标均未见相关关系，这一结果与Sellam等[13]的研究结果较为相似：CCL19水平与RF滴度相关，但与抗CCP抗体滴度及上述其他指标无相关性。RF和抗CCP抗体本质是球蛋白，由B细胞分化为浆细胞后分泌产生。因此，我们推测血清CCL19水平代表的是患者体内的免疫活动度，特别是B细胞分泌抗体的活跃程度，而非RA的炎性活动度。本研究中治疗后的RA患者血清CCL19表达之所以降低，是因为相关治疗抑制了B细胞的活化，进而抑制了CCL19的表达及抗体的产生。

为了确证血清CCL19水平与疾病活动的关系，本研究将RA患者分为高/低疾病活动组、RF阳性/阴性组、抗CCP抗体阳性/阴性组，对比分析CCL19的表达差异，发现CCL19表达在抗CCP抗体阳性组明显高于阴性组，但在高、低疾病活动组间CCL19表达差异无统计学意义，这一结果进一步证实了CCL19可以作为反映RA患者体内B细胞分泌抗体功能活跃的指标。

抗体是由B细胞活化并分化为浆细胞后分泌产生的，能分化为浆细胞的B细胞主要是CD27+B细胞，即记忆B细胞[14]。IgD在B细胞上的出现标志着B细胞的成熟[15]，以IgD和CD27为表面标记将记忆B细胞进行亚群的划分是常见的分群方法。本研究进一步深入分析了RA中与抗体滴度相关的CCL19与B细胞及记忆B细胞相关亚群的关系，发现CCL19与B细胞及记忆B细胞的数量并无显著的相关关系。这一结论提示，RA中CCL19的高表达并非取决于B细胞的数量，很有可能取决于B细胞的功能状态。

基于如上假设，本研究将HC人群和RA患者外周血CD27+记忆B细胞各亚群进行了对比，发现RA患者中记忆B细胞各亚群的数量均显著低于HC人群，即便如此，RA患者血清中依然有与CCL19一致高表达的RF及抗CCP抗体等球蛋白，这意味着RA外周血中记忆B细胞数量减少但功能却异常活跃。

本研究也存在一些不足之处，目前关于CCL19预判RA中B细胞功能活跃的结论多为间接证据，如果能直接对比该类RA患者B细胞的功能状态将得到更为直接的证据，这也是我们后续研究中将要深入探讨的问题，这一问题的解决有助于更进一步明确B细胞介导的RA致病机制。

综上所述，RA患者血清中高表达的CCL19是一个与RF及抗CCP抗体滴度密切相关的趋化因子，其表达水平可以预判RA患者的免疫活动状态，推断该RA患者是否存在B细胞功能活跃，从而指导临床医师是否启动针对B细胞的相关治疗。

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(2014-11-27收稿)

(本文编辑：赵波)

ClinicalsignificanceofserumC-Cchemokineligand19levelsinpatientswithrheumatoidarthritis

SHILian-jie1，LIJian-hong2，HUFan-lei1，LIMin3，ZHANGJie4，LIJiang-tao4，LIZhan-guo1△

(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology,PekingUniversityPeople’sHospital,Beijing100044,China; 2.DepartmentofNuclearMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China; 3.DepartmentofRheumatology,SichuanOrthopedicHospital,Chengdu610041,China; 4.DepartmentofRheumatology,TheFirstPeople’sHospitalofYibin,Yibin644000,Sichuan,China)

Objective：ToinvestigatetheserumlevelofC-Cchemokineligand19 (CCL19)anditsclinicalsignificanceinrheumatoidarthritis.Methods:TheserumCCL19levelsinbothrheumatoidarthritis(RA)patientsandhealthcontrolsweredetectedbyELISA.TheproportionofperipheralbloodBcellsandmemoryBcellsubsetswerealsodetectedinsomepatients.Thentheclinicalandlaboratorydataofthepatientswerecollected.TheCCL19levelsinpatientswithdifferentclinicalfeatureswereanalyzed.Andthecorrelationbetweentheclinicaldata,laboratoryparameters,BcellsubsetsproportionandserumCCL19levelswerealsoanalyzed.Independentsamplesttest,pairedttest,PearsonandSpearmancorrelationwereusedforstatisticalanalysis.Results:ThelevelsofCCL19washigherintheRApatientsthanthehealthcontrols(P<0.05).TheserumCCL19levelsweredecreasedintheRApatientswhoaccep-teddisease-modifyinganti-rheumaticdrugs(DMARDs)treatmentfor6months(P<0.001).SerumCCL19levelswerecorrelatedwiththetitersofbothrheumatoidfactor(RF)andanti-cycliccitrullinatedpeptide(CCP)antibody(r=0.42, P=0.002; r=0.33, P=0.013),butnotwitherythrocytesedimentationrate(ESR),C-reactiveprotein(CRP)anddiseaseactivityscorein28joints(DAS28) (P>0.05).ThelevelsofCCL19werehigherintheserumpositive(RFandanti-CCPantibody)patients,buttherewerenodifferencesbetweenlowandhighdiseaseactivityRA,aswellasearlyandnon-earlyRA.TherewasnocorrelationbetweentheserumCCL19levelsandtheproportionofBcellsaswellasmemoryBsubsets.AlltheproportionofperipheralbloodCD27+memoryBcellsubsetsinRAwaslowerthanthehealthycontrols,includingCD27+IgD+,CD27+IgD-andCD27+Bcells.Conclusion:TheincreasedserumCCL19levelsinRApatientsareassociatedwiththeactivityofBcells,soCCL19mightpredictwhethertheRAtypeisaBcellmediatedRA,andspecifythetreatmentdirectionsfortherheumatologist.

Arthritis,rheumatoid;ChemokineCCL19;Rheumatoidfactor;Antibodies;B-lymphocytes

R593.22

A

1671-167X(2016)04-0667-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.020

△Correspondingauthor’se-mail,zgli99@aliyun.com

网络出版时间：2016-6-2914:18:33网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160629.1418.016.html