复方黄芪养心合剂对缺血性心律失常大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43磷酸化和去磷酸化的影响

祝丹，陈启兰，祝光礼，赫小龙

(浙江中医药大学附属广兴医院/杭州市中医院 心血管病科，浙江 杭州 310007)

复方黄芪养心合剂对缺血性心律失常大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43磷酸化和去磷酸化的影响

祝丹，陈启兰Δ，祝光礼，赫小龙

(浙江中医药大学附属广兴医院/杭州市中医院 心血管病科，浙江 杭州 310007)

目的观察预防性应用复方黄芪养心合剂(compound huangqi yangxin mixture，CAMNH)对缺血性心律失常大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白(connexin，Cx)Cx43磷酸化(P-Cx43)和去磷酸化(NP-Cx43)的影响及是否存在量效关系。方法将60只雄性SD大鼠随机分成西药组(A组)、复方黄芪养心合剂小剂量组(B组)、复方黄芪养心合剂中剂量组(C组)、复方黄芪养心合剂大剂量组(D组)、模型组(E组)、假手术组(F组)。用复方黄芪养心合剂大(28 g/kg·d)、中(14 g/kg·d)、小(7 g/kg·d)剂量灌胃、西药组用琥珀酸美托洛尔(9.5 mg/kg·d)灌胃、模型组和假手术组用生理盐水(7 g/kg·d),灌胃2 w。2 w后结扎冠状动脉左前降支建立大鼠急性缺血性心律失常模型，观察缺血30 min之内心律失常情况。30 min后处死大鼠，取心脏标本，采用免疫印迹法(Western blot法)分析比较P-Cx43、NP-Cx43的变化。结果Western blot法研究发现西药组、复方黄芪养心合剂小、中、大剂量组NP-Cx43浓度增加小于模型组和假手术组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；西药组、复方黄芪养心合剂小、中、大剂量组P-Cx43浓度增加大于模型组和假手术组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)，且NP-Cx43、P-Cx43在复方黄芪养心合剂大剂量组与西药组表达结果相似。结论复方黄芪养心合剂具有抗缺血性心律失常作用，且其抗心律失常可能与其减少缝隙蛋白Cx43的去磷酸化、增加磷酸化表达有关，同时复方黄芪养心合剂的剂量与其减少缝隙连接蛋白Cx43的去磷酸化，增加磷酸化的表达存在一定相关性。

大鼠；Cx43；复方黄芪养心合剂；缺血性心律失常；美托洛尔

缺血性心脏病主要是指由于心脏的血液灌注减少，引起血液对心脏的供氧减少，导致心肌及其细胞的能量代谢发生异常，从而心脏不能维持其正常工作的一种病理状态[1]。心肌缺血产生的最直接后果是心功能下降，而对于有基础性心脏病如冠心病的患者则会引起心绞痛、心律失常。无论何种类型的心肌缺血，往往会引发心律失常，其中80%及以上为室性心律失常[2]。室性心律失常中室速、室颤引起死亡的风险极高。据不完全统计，急性心梗患者中有50%以上死于致命性的室性心律失常。心肌缺血是一种与年龄相关的多因素综合作用的进展性疾病，因此明确缺血性心律失常的发生机制，寻找防治方法是当前急需解决难题之一。复方黄芪养心合剂(CAMNH)为本院院内制剂(浙药制字Z20100032)，在临床治疗中观察到其具有一定的抗心律失常作用。现为CAMNH更好的运用于临床，进一步探求其抗心律失常的作用机制，对其与心律失常相关机制Cx43作研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016]，体重180～200 g，清洁级，无人畜共患疾病。

1.1.2 药品与试剂：①中药：复方黄芪养心合剂(黄芪20 g、党参20 g、太子参20 g、苦参20 g、甘松20 g、炙甘草10 g、生山楂15 g，由杭州市中医院中药房提供)；②西药：琥珀酸美托洛尔(阿斯利康制药有限公司，生产批号：1312028，47.5 mg/7片·盒)，戊巴比妥钠(达文生物科技有限公司,批号:WS20080118，25 g/瓶)；③氯化钠溶液(杭州市中医院，500 mL/瓶)

1.1.3 DH-150动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂，DH150),Medlab-U/4CS生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司，Medlab-U/4CS),低温冰箱(日本SANYA公司，MDF-U5411)。手术材料：眼科剪、手术剪、血管钳、持针器、组织镊、冻存管、刀片、生化管等。

1.2 方法

1.2.1 实验分组给药方法：将60只SD雄性大鼠按随机数字表法均分为西药组(A组)、复方黄芪养心合剂小剂量组(B组)、复方黄芪养心合剂中剂量组(C组)、复方黄芪养心合剂大剂量组(D组)、模型组(E组)、假手术组(F组)，每组10只。给药剂量：A组给予琥珀酸美托洛尔9.5 mg(kg·d)灌胃， B组给予复方黄芪养心合剂7 g(kg·d)灌胃，C组给予复方黄芪养心合剂14 g(kg·d)灌胃，D组给予复方黄芪养心合剂28 g(kg·d)灌胃，E组给予氯化钠溶液7 g(kg·d)灌胃，F组给予氯化钠溶液7 g(kg·d)。灌胃干预时间为2 w。

1.2.2 SD大鼠缺血性心律失常模型的制作：造模方法：冠状动脉左前降支高位结扎法[3]，具体操作方法如下：大鼠称重，麻醉，固定，消毒，分离颈部筋膜及肌肉，暴露气管，将动物呼吸机插管插入气管内，固定，动物呼吸机选择潮气量3 mL/100 g，呼吸频率60次/分，呼吸比2:1，见大鼠胸部随呼吸机起伏，证明气管插管成功。接入大鼠Ⅱ导联心电图，通过Medlab-E观察大鼠心电图，连续记录。消毒胸部皮肤，逐层顿性分离浅深筋膜及肌肉，暴露第3～5肋骨并剪断，用镊子轻轻撕破心包，充分暴露心脏血管。用5-0的线在左心耳下的左冠状动脉前降支根部下2～3 cm处结扎。结扎成功的标志为心电图导联上ST段抬高大于0.2 mv以上。结扎时间为30 min，之后，取下心脏标本。A、B、C、D、E组造模方法均同上，F组基本方法同上，但只穿线，不结扎。

1.2.3 Western blot测定大鼠心肌细胞膜P-Cx43、NP-Cx43蛋白的表达：①心肌组织蛋白提取：取左心室心肌组织1000 mg+1000 μL RIPA裂解液，放入组织玻璃匀浆器匀浆离心。取上清液加入EP管保存；②BCA法测蛋白浓度：操作方法见试剂盒说明书；③制胶：10%分离胶(20 mL)，5%浓缩胶(6 mL)④加样及电泳：将预先准备好的蛋白样品加入凝胶加样孔中。用不同电压跑胶，待溴酚蓝到达分离胶底部，电泳结束；⑤转膜：用甲醇激活PVDF膜后，在转膜液中组装“三明治”(胶、PVDF膜、滤纸3层、衬垫)后，用150 mA恒流电转膜1.5 h；⑥一抗孵育：将膜加入15～20 mL一抗稀释液，水平摇床上3档孵育过夜；⑦二抗孵育：二抗15～20 mL，水平摇床上3档孵育1.5 h；⑧显影：将ECL发光试剂按1:1配置，将混合液滴加如PVDF膜上，在膜上覆盖保鲜膜，在暗室中，将膜及X胶片压于暗匣中曝光。再将X胶片显影，定影，晾干；⑨凝胶成像及定量测算：将晾干后的胶片在专用系统中拍照及测算。

2 结果

2.1 造模前，大鼠Ⅱ导联心电图示心率大多大于400次/分，P波、QRS波、T波显示清晰。在冠状动脉左前降支结扎后，可见Ⅱ导联心电图中R波振幅较前明显抬高，而ST段抬高多大于0.2 mv或者以上，结扎时间30 min。观察到心律失常(室上速、室速、室颤)开始时间、发生阵数药物组均低于假手术组。

2.2 Western blot结果

2.2.1 蛋白定量(BCA法测定蛋白浓度)：R2=0.9954，代表蛋白浓度测试准确，蛋白浓度含量数据可靠。

2.2.2 Cx43(包括P-Cx43、NP-Cx43)蛋白条带可在40-43kD附件出现一至多个特异性条带，这可能和目的蛋白的质量和特异性有关。根据预染Marker提示P-Cx43、NP-Cx43的电泳条带与理论值相符，一般为43 kD。选择GAPDH(分子量为36 kD)作为内参。见图1。

图1 各组P-Cx43、NP-Cx43电泳结果Fig.1 P-Cx43,P-Cx43 electrophoresis bands in each group

P-Cx43：与F组比较，E组P-Cx43表达明显减少(P<0.05)，A、B、C、D组P-Cx43表达也减少(P<0.05)，各组P-Cx43表达减少的程度比E组少(P

表1 心肌细胞P-CX43在各组的磷酸化水平Tab.1 P-CX43 phosphorylation in cardiomyocytes in each group (±s)

*P<0.05,与E组、F组比较，compared with group E and group F

NP-Cx43：与F组比较，E组NP-Cx43表达明显增加(P<0.05)，A、B、C、D组NP-Cx43表达也增加(P<0.05)，各组NP-Cx43表达增加的程度比E组少(P<0.05)，D组NP-Cx43表达增加的程度与A组接近(P<0.05)，比B、C组NP-Cx43表达增加少(P<0.05)，且B组NP-Cx43表达增加比C组少(P<0.05)。见表2。

表2 心肌细胞NP-CX43在各组的去磷酸化水平Tab.2 The levels of NP-CX43 dephosphorylation in myocytes in each group (±s)

*P<0.05,与E组、F组比较，compared with group E and group F

3 讨论

MSSRT是一种β受体阻断剂，是目前临床上最常用的抗心律失常药物之一[4]。现代药理研究表明，它能阻滞交感神经系统与RAS系统，从而降低心律，减少心肌氧耗[5]。缺血性心律失常的发生正是由于心肌缺血时，引起心肌能量代谢发生变化，心肌氧耗增加有关。

中医中并无心律失常的说法，因心律失常多表现为“心动悸、脉结代”，故心律失常在中医中归于“心悸”范畴。其病位在心，与其他脏腑之病均有一定相关性。多属本虚标实，虚实夹杂之证。

复方黄芪养心合剂作为本院院内制剂多年，在前期临床观察中，我们发现该方能明显改善患者临床症状，减慢心率，且无明显的不良反应；而在进行该方抗缺血再灌注损伤的实验研究[6]中我们发现，复方黄芪养心合剂组在缺血30 min时其心律失常发生率明显低于其他组，它能降低患者循环容量水平，同时有改善慢性心衰血流动力学指标及保护心脏的作用。复方黄芪养心合剂其药物组成：黄芪20 g、党参20 g、太子参20 g、苦参20 g、甘松20 g、炙甘草10 g、生山楂15 g。方中黄芪、党参、太子参共同起到补益心气；苦参清心经之火；山楂活血祛瘀；甘松理气；炙甘草调和诸药。全方配伍共奏益气活血，祛瘀清心之功效。

缝隙连接(gap junction GJ)是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。GJ主要功能：①电偶联作用。②细胞间离子、 营养物质和液体的迅速交换。③在胚胎的形成、生长和发育过程中调控细胞间信号的传递。④调控细胞的生长和分化。⑤提高细胞对激素的应答。哺乳动物心脏中，心肌细胞间GJ通道主要由3种GJ连接蛋白构成，其分别是Cx40、Cx43、Cx45。而在心室肌中则以Cx43为主[7-12]。

在心肌缺血发生时，心肌中的Cx43大量降解，它是最易降解的结构蛋白之一。伴随着Cx43大量降解，引起其分布模式的改变，从而导致心肌细胞间失电耦联，减慢传导速度，发生传导异性。而这一系列改变的最终结果是传导阻滞和折返性传导，这往往诱发心律失常[13]。因此，我们可以说Cx43的降解和分布模式改变是心肌急性缺血后心肌在分子水平上发生的最初重构，也是心肌细胞间失电耦联和心律失常的解剖学基础。

大多数的连接蛋白归类于磷蛋白，但是每个连接蛋白所处的磷酸化水平是不同的。蛋白转录过程中磷酸化是一种最为普遍的修饰。磷酸化调控着细胞信号的转导过程，主要通过蛋白激酶 (protein kinases，PKS)和蛋白磷酸化酶(protein phosphatases ，PPS)的作用，来控制细胞的内过程。Cx43的主要功能部分为羧基端，而羧基端的部分丝氨酸和苏氨酸残基可以发生磷酸化，其发生磷酸化后可以影响Cx43在细胞膜中作用，如组装、降解及传导。可以说磷酸化是其发挥正常的生物学功能的重要步骤。

Hung等[14]对犬发生急性心肌缺血后的Cx43进行了研究，发现发生急性心肌缺血时，闰盘处Cx43几乎全部消失，而在细胞侧对侧处，仍有少许Cx43存在。闺纯英等[15]认为犬急性缺血后闰盘处Cx43明显减少，但分布模式并没有发生明显的改变，这可能与研究方法有一定的关系。章诗伟等[16]认为，由于急性心肌缺血所导致的心源性猝死者中，其左侧心室的心肌细胞闰盘处的Cx43发生去磷酸化的比例大大增加。这些结果均告诉我们一个事实，就是一旦发生急性心肌缺血时，心肌细胞中闰盘处Cx43的含量、分布均可能已经发生了改变。由此我们可以推测心肌闰盘处可能是发生急性缺血时最先出现细胞间失耦联的地方，也很可能是心律失常的起源部位。

Cx43的磷酸化主要发生在转运到细胞膜之前，发挥作用的主要是丝氨酸的部分残基；少部分的磷酸化也可以发生在其到达细胞膜之后。由于磷酸化的程度不同，Cx43在SDS-PAGE电泳凝胶上就可以多个条区带，其分子量主要分布在40～47kDa[17-18]。

实验结果及分析：据Western blot法结果，大鼠心肌缺血区磷酸化P-Cx43表达减少，去磷酸化NP-Cx43表达增加，心律失常发生率增加。但预防性运用复方黄芪养心合剂后Cx43的磷酸化较E、F组增加，去磷酸化较E、F组减少，同时复方黄芪养心合剂药物剂量与其Cx43表达磷酸化及去磷酸化有一定关系，剂量越大去磷酸化表达越少。从而证实了复方黄芪养心合剂抗心律失常作用与药物剂量有关，剂量大抗心律失常作用强。

综上所述，复方黄芪养心合剂能保护因缺血造成的心律失常，其抗心律失常作用可能与其调节Cx43结构稳定性有关，复方黄芪养心合剂能维持缺血区Cx43磷酸化，减少去磷酸化，且与使用剂量有关。

[1] 杨宝峰.药理学.第6版[M].北京：人民卫生出版社，2005：208-220.

[2] 张文峰.冠脉搭桥对犬梗死周边心肌交感神经重构与电重构的影响[D].沈阳：中国医科大学，2008.

[3] 刘涛，王伟，赵明镜，等.左冠状动脉前降支结扎法制作大鼠心肌梗死模型.实验动物与比较医学，2009，29(2)：120-123.

[4] 郭艺芳.β受体阻滞剂是否可以常规用于所有冠状动脉性心脏病患者[J].中华高血压杂志，2015，23(2)：109-114.

[5] 李文安.稳心颗粒联合美托洛尔治疗冠心病合并心律失常的疗效观察[J].中国医药科学，2016，6(6)：22-24.

[6] 陈启兰，龚一萍，祝光礼，等.复方黄芪养心合剂对缺血再灌注大鼠室性心律失常的作用[J].浙江中医杂志，2013，48(4)：267-269.

[7] Dupont E,Ko Y, Rothery S, et al.The gap -junctionalprotein connexin 40 iselevated in patients susceptible to postoperative atrial fibrillation[J].Circulation,2001,103(6):842-849.

[8] Kanagaratnam P, Rothery S, Patel P,et al.Relative expression of immunolocalized connexins 40 and 43 correlateswith human atrial conduction properties[J].J Am Coll Cardio,2002, 39(1):116-123.

[9] Hagendorf A, Schumacher B,Kirchhof S,et al.Conduction disturbances and increased atrialvulnerability in connexin40 -deficienmice analyzed by transesophageal stimulation[J].Circulation,1999,99(11):1508-1515.

[10] Beardslee MA,Lerner DL,Tadros PN,et al.Dephosphorylation and intracellular redistribution of ventricular connexin43 during electrica luncoupling induced by ischemia[J].Circ Res,2000,87(8):656-662.

[11] LiaoY,Day KH,Damon DN, et al.Endothelial cell-specific knock-outof connexin 43 causes hypotention bradycardiain mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001, 98(17):9989-9994.

[12] Jongsma HJ,Wilders R.Gapjunctions in cardiovascular disease[J].Circ Res,2000,86(12):1193-1197.

[13] Harris AL.Voltage-sensing and substrate rectification:moving parts of connexin channels[J].J Gen Physiol,2002,119(2):165-169.

[14] Hung XD,Sandushy GE,Zies DP.Hetogeneous loss of connexin Cx43 protein in ischemic dog heart[J].Cardiol Electrophysiol.1999,10(1):79-88.

[15] 闫纯英，林吉进，李玉光，等.间隙连接通道蛋白不均一降解对心肌传导速度影响的研究[J].中国分子心脏病学杂志，2003，3(4)：226-229.

[16] 章诗伟，刘世新，邓立彬，等.急性心肌缺血碎死例左室心肌Cx43脱磷酸化的免疫组化研究[J].法医学杂志，2004，20(3)：136-142.

[17] Peter NS,Green CR,Poole-wilson PA,et al.Reduced content of connexin43 gap junctions in ventricular myocardium from hyper trophyiedand ischemic human hearts[J].Circulation,1993,88(3):864-875.

[18] Lampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(7):1171-1186.

(编校：苗加会)

EffectsofcompoundHuangqiYangxinmixtureonphosphorylationanddephosphorylationofconnexinCx43inischemicarrhythmiarats

ZHU Dan, CHEN Qi-lanΔ, ZHU Guang-li, HAO Xiao-long
(Cardiovascular Disease Department,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University/Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, China)

ObjectiveTo study the impact of prevention use of compound astragalus membranaceus yangxin mixture(CAMNH)on normal SD male rat as well as the impact on phosphorylation and dephosphorglation of myocardial cells gap junction protein (Connexin, Cx) Cx43，and whether it has dosage relation with phosphorylation (P-Cx43) and dephosphorylation (NP-Cx43) expression of gap junction protein Cx43.MethodsRandomly allocate 60 male SD rats into western medicine group (Group A)，low dose of CAMNH group (Group B)，medial-dose CAMNH group (Group C)，high dose CAMNH group (Group D)，model group (Group E)，and sham operation group (Group F).Conduct intragastric administration to rat with high large dose(28 g/kg·d), medial dose(14 g/kg·d) and low dose(7 g/kg·d) of CAMNH；the western medicine group(9.5 mg/kg·d) conduct intragastric administration with metoprolol, model group and sham operation group(7 g/kg·d) conduct intragastric administration with Saline, all for two weeks’ intervention.Ordinary condition of rats to be observed during the time.Conduct Left anterior descending coronary artery after two weeks and build up model of rats’acute ischemic arrhythmias, and observe the arrhythmia and ordinary condition of the rats in 30 mins Ischemia.Kill the rats after 30 mins, take heart sample, analyze after test of Cx43 by westrn blot.ResultsWestern blot found out that the level increase of P-Cx43 of western medicine group, low dose, medial dose and large dose of CAMNH were less than model group and sham operation group, and there was statistically significant difference between the groups(P<0.05).In addition, the high dose CAMNH group achieved similar expression result of NP-Cx43, P-Cx43 as western medicine group, and there was statistically significant difference between the groups.ConclusionThe prevention use of CAMNH can resist ischemic arrhythmia.CAMNH’s antiarrhythmic effect is related with its decrease of the dephosphorylation of gap junction as well as increase of phosphorylation, and there is dose-effect in between.

rats; Cx43; CAMNH; ischemic arrhythmia; metoprolol

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.008

浙江省中西医结合学会(2012LY007)

祝丹，女，硕士，住院医师，研究方向：中医药对心血管疾病的防治，E-mail：382436681@qq.com；陈启兰，通信作者，女，博士，副主任医师，研究方向：中医药对心血管疾病的防治，E-mail：cql13588750941@qq.com。

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