金英黄归汤中几个有效成分的分析

周送桂，，李　欣，李中改，张小艺，王　鲁，何　珺

（1.贵州大学贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

金英黄归汤中几个有效成分的分析

周送桂1，2，李欣3，李中改3，张小艺3，王鲁1，何珺1

（1.贵州大学贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

为了研究自制金英黄归汤中的有效成分。采用紫外分光光度法和高效液相色谱法定量检测金英黄归汤中几个有效成分，以期为金英黄归汤的质量控制提供一定的参考依据。结果：紫外分光光度法测得金英黄归汤中总皂苷、总黄酮和总多糖的含量分别为1.835 mg/mL和0.091 mg/mL、98.96 mg/mL；高效液相色谱法测得金英黄归汤中槲皮素、芦丁、木犀草素、绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、阿魏酸的含量分别为1.69 μg/mL、1.70 μg/mL、0.71 μg/mL、32.45 μg/mL、36.43 μg/mL、3.56 μg/mL、0.95 μg/mL。表明绿原酸、连翘酯苷A、总多糖在金英黄归汤中占有较大的含量，可以确定为本制剂的质量控制指标。

金英黄归汤；紫外分光光度法；高效液相色谱法；有效成分分析

我们前期试验研制的金英黄归汤对金黄色葡萄球菌引起乳房炎的家兔血清及乳汁中IL-6和TNF-α的分泌有显著的抑制作用[1-2]，在奶牛隐性乳房炎的治疗方面也取得良好的效果[3]。本复方是由金银花、连翘、蒲公英、大黄、当归等组成的中药制剂，具有清热解毒、消肿散结之功效[3]。为了探明其所含有的主要有效成分，进而完善其质量控制体系，提高其临床用药的安全性与有效性，我们采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）对其中几个有效成分进行分析。以期为其制剂的质量控制及进一步研究金英黄归汤提供一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料金银花、蒲公英、当归等7味中药，2013年购自贵阳市同济堂药店（药品GMP证号：QianJ0190）；芙蓉花，2013年10月采自贵阳花溪湿地公园。

1.2试剂绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：119753-201314，纯度>96.65）；连翘酯苷A对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：HN1116XA13，纯度≥98%）；槲皮素对照品（美仑生物技术有限公司、批号：MB2127，纯度≥98%）；大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：GR43-NH03，纯度≥98%）；芦丁对照品（Sigma，批号：14H05521，纯度≥95%）；木犀草素对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：YA0408YA13，纯度≥98%）；皂苷对照品与黄酮对照品，均购自中国药品生物制品检定所，有机化学试剂均为国产分析纯或色谱纯试剂。

1.3主要仪器Agilent 1260 Infinity液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；SPD-10A紫外检测器，北京京科瑞达科技有限公司；MultiskanGo型全波段酶标仪，Thermo公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚莱生化仪器厂；SG2200H超声波清洗机，上海冠特超声仪有限公司。

1.4方法

1.4.1金英黄归汤的制备将8味中药按比例混合，称取200 g，按参考文献[4]的方法制备成1 mg/mL的金英黄归汤。

1.4.2紫外分光光度法分析制剂中总皂苷、总黄酮和多糖参考文献[6-7]，建立皂苷对照品的标准曲线。精密称取经干燥至恒重的金英黄归汤的固体粉状0.0030 g，精密加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀，置60℃恒温水浴加热20 min，取出，立即置冰水浴中冷却15 min，加入5 mL冰醋酸，摇匀，同时做空白。于560 nm测定其吸光度值，重复3次，取平均值。根据标准曲线方程计算总皂苷的含量。

按[8-9]建立黄酮对照品的标准曲线。精密称取经干燥至恒重的金英黄归汤的固体粉状0.5 g 2份，分别定容至50 mL容量瓶中，精密吸取样液0.5 mL，加入干燥具塞试管中，依次加入9 mL的0.1 mg/mL三氯化铝，再依次分别加入0.5 mL的蒸馏水，摇匀，于420 nm处测定吸光度，同时做试剂空白。测定其吸光度值，重复3次，取平均值。根据标准曲线方程计算总黄酮的含量。

按参考文献[10-11]建立葡萄糖对照品的标准曲线。精密量取金英黄归汤0.01 mL至具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，摇匀，加1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再迅速加入5.0 mL浓硫酸，迅速摇匀，室温静置10 min，40℃条件下放置18 min，用蒸馏水做空白，在490 nm处测定吸光度，重复3次，取平均值。根据标准曲线方程计算其多糖含量。

1.4.3HPLC法分析制剂中槲皮素、芦丁、木犀草素、绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、咖啡酸。

1.4.3.1槲皮素的含量测定按参考文献[12-13]用甲醇制备0.291 mg/mL的槲皮素对照品溶液。另外精密量取金英黄归汤0.1 mL，置于25 mL的具塞锥形瓶中，加9.9 mL的水解液（甲醇∶4 mol/L盐酸=7∶3）溶解，超声处理至完全溶解，放置冷却，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得浓度为10 mg/mL的供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，在流动相为甲醇∶0.4%磷酸（48∶52），流速为0.8 mL/min，柱温为45℃，检测波长为360 nm的色谱条件下检测。根据公式（C 样=C标×A样/A标）计算槲皮素的含量。

1.4.3.2芦丁的含量测定按参考文献[14-15]用甲醇制备0.050 mg/mL的芦丁对照品溶液。另精密量取金英黄归汤0.1 mL，以芦丁流动相为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在流动相为甲醇∶0.4%磷酸（32∶68），检测波长为360 nm，柱温为30℃，流速为0.8 mL/min的色谱条件下检测。根据上述公式计算芦丁的含量。

1.4.3.3木犀草素的含量测定按参考文献[16-17]用甲醇制备0.270 mg/mL的木犀草素对照品溶液。另精密量取金英黄归汤0.1ml，以甲醇：25%盐酸（4∶1）为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在流动相为四氢呋喃∶甲醇∶1.5%醋酸（27∶4∶69），流速为1.0 mL/min，检测波长为353 nm，柱温为40℃的色谱条件下检测。根据上述公式计算木犀草素的含量。

1.4.3.4绿原酸的含量测定按参考文献[18-19]，用绿原酸流动相（乙腈∶0.2%磷酸（11∶89）制备0.217 mg/mL的绿原酸对照品溶液。另精密量取金英黄归汤0.1 mL，以绿原酸流动相为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在检测波长为327 nm，柱温为35℃，流速为0.8 mL/min的色谱条件下检测。根据上述公式计算绿原酸的含量。

1.4.3.5连翘酯苷A的含量测定按参考文献[20-21]用连翘酯苷A流动相（乙腈∶0.4%冰醋酸（17∶83）制备0.268 mg/mL的连翘酯苷A标准品溶液，另精密量取金英黄归汤0.1 mL，以其流动相为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在检测波长为330 nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min的色谱条件下检测。根据上述公式计算连翘酯苷A的含量。

1.4.3.6连翘苷的含量测定按参考文献[14，18]用甲醇流动相制备0.249 mg/mL的连翘苷标准品溶液，另精密量取金英黄归汤0.1 mL，以甲醇为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在以乙腈∶水（25∶75）为流动相，检测波长为227 nm，柱温为25℃，流速为1.0 mL/min的色谱条件下检测。根据上述公式计算连翘苷的含量。

1.4.3.7阿魏酸的含量测定按参考文献[22]用70%甲醇制备0.268 mg/mL的阿魏酸标准品溶液，另精密量取金英黄归汤0.1 mL，以70%甲醇为溶剂，按“1.4.3.1”项制备供试品溶液与进样，在以乙腈∶0.085%磷酸溶液（17∶83）为流动相，检测波长为316 nm，柱温为35℃，流速为1.0 mL/min的色谱条件下检测。

2　试验结果

2.1金英黄归汤中总皂苷、总黄酮、总多糖的含量测定根据测定的结果，以吸光度对浓度进行回归分析，绘制标准曲线（见图1、2、3）。得出皂苷直线回归方程为y=4.6097x-0.0210（R2=0.9960），黄酮直线回归方程为y=3.9243x+0.0100（R2=0.9624），多糖直线回归方程为y=2.9878x-0.1509（R2=0.9995）。根据各标准曲线方程，计算得金英黄归汤冻干粉中总皂苷、总黄酮和总多糖的含量分别为1.835 mg/mL、0.091 mg/mL、98.96 mg/mL。

图1　皂苷的标准曲线

图2　黄酮的标准曲线

图3　葡萄糖的标准曲线

2.2槲皮素、芦丁、木犀草素、绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、咖啡酸的含量测定槲皮素标准品HPLC图与供试品HPLC图如4、5图所示，根据公式计算，得出金英黄归汤中槲皮素含量为1.69 μg/mL。

图4　槲皮素对照品HPLC色谱图

图5　槲皮素供试品HPLC色谱图

卢丁标准品HPLC图与供试品HPLC图如6、7图所示，根据公式计算，得出卢丁含量为1.70 μg/mL。

木犀草素标准品HPLC图与供试品HPLC图如8、9图所示，根据公式计算，得出木犀草素含量为0.71 μg/mL。

图6　芦丁对照品HPLC色谱图

图7　芦丁供试品HPLC色谱图

图8　木犀草素对照品HPLC色谱图

绿原酸标准品HPLC图与供试品HPLC图如10、11图所示，根据公式计算，得出绿原酸含量为32.45 μg/mL。

连翘酯苷A标准品HPLC图与供试品HPLC图如12、13图所示，根据公式计算，得出连翘酯苷A含量为36.43 μg/mL。

图9　木犀草素供试品HPLC色谱图

图10　绿原酸对照品HPLC色谱图

图11　绿原酸供试品HPLC色谱图

图12　连翘酯苷A对照品HPLC色谱图

图13　连翘酯苷A供试品HPLC色谱图

连翘苷标准品HPLC图与供试品HPLC图如14、15图所示，根据公式计算，得出连翘苷含量为3.56 μg/mL。

图14　连翘苷对照品HPLC色谱图

阿魏酸标准品HPLC图与供试品HPLC图如16、17图所示，根据公式计算，得出阿魏酸含量为0.95 μg/mL。

图15　连翘苷供试品HPLC色谱图

图16　阿魏酸对照品HPLC色谱图

3　讨论

中药作为治疗疾病的药品，质量标准是保证其临床用药安全性的关键，其中质量控制是质量标准体系的主要部分。但中药大部分是复方药，其成分复杂难以一一确定，对于中药复方的质量控制只能做到对其主要有效成分进行含量的控制。本文的研究目的旨在前期对金英黄归汤的定性试验的基础上，通过紫外分光光度法和高效液相色谱对其中几个有效成分进行含量测定，来探讨出金英黄归汤中的主要有效成分，进而对其进行质量控制。

图17　阿魏酸供试品HPLC色谱图

近年来皂苷类和黄酮类化合物的药理作用是研究热点，皂苷具有抗缺氧、抗疲劳、抗脂质氧化及抗癌等作用，黄酮具有降低血脂、抗肝病毒、抗炎、抗菌与抗病毒及解痉等作用。此外，中药多糖因其具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗溃疡、抗糖尿病、降血脂、抗凝血及免疫调节等多种药理作用也越来越引起人们的关注。本课题组在金英黄归汤中药化学成分定性结果的基础上，结合前期金英黄归汤药效的研究对金英黄归汤中总皂苷、总黄酮和多糖进行含量测定。测得金英黄归汤中总皂苷、总黄酮和多糖的含量分别为1.835 mg/mL、0.091 mg/ mL和98.96 mg/mL。这为下一步金英黄归汤的有效成分研究及药效评价提供了可靠的数据。

金银花、蒲公英、连翘为金英黄归汤的主药，2010年版药典[16]中也增加了金银花中绿原酸的含量测定和连翘中连翘酯苷A的含量测定指标。因而将金银花中绿原酸和木犀草素，蒲公英中芦丁，连翘中槲皮素、连翘酯苷A和连翘苷及大黄中大黄素当归中阿魏酸也确定为本试验含量测定的对象。为了考察这几个有效成分经过制备工艺后含量的改变，我们采用HPLC对这几个有效成分进行了含量测定。定量试验结果表明，金英黄归汤中含量较多的是绿原酸与连翘酯苷A和总多糖，测得其含量分别为3.245 μg/mL、3.643 μg/mL和98.96 mg/mL。而槲皮素、芦丁、木犀草素、连翘苷、阿魏酸经过金英黄归汤的制备过程后含量比较低，测得含量结果分别为0.169 μg/mL、0.170 μg/mL、 0.071 μg/mL、3.56 μg/mL及0.95 μg/mL。试验结果说明，绿原酸与连翘酯苷A和总多糖在金英黄归汤的制备过程中比较稳定且含量较高，可以确定为金英黄归汤的质量控制指标及后期研究的主要有效成分对象。

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Theanalysis of several effectivecomponents ofJ inying Huangguipreparation

ZHOU Song-gui1，2，LI Xin3，LI Zhong-gai3，ZHANG Xiao-yi3，WANG Lu1，HE Jun1
（1.Biochemistry Engineering Center of Guizhou Province，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.College of pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

To study the ingredient of Jinying Huanggui prepared by our laboratory.In order to provide certain reference basis for future experiments about the quality control of Jinying Huanggui，some active ingredients were quantitatively detected by Ultra⁃violet spectrophotometry and High performance liquid chromatography.The content of total saponin，total flavone and total polysac⁃charides of Jinying Huanggui measured by Ultraviolet spectrophotometry were 1.835 mg/mL-1，0.091 mg/mL-1and 98.96 mg/mL-1，respectively.The contents of quercetin，rutin，mignonette，chlorogenic acid，forsythosides A，phillyrin and ferulic acid measured by High performance liquid chromatography were 1.69 μg/mL-1，1.70 μg/mL-1，0.71 μg/mL-1，32.45 μg/mL-1，36.43 μg/mL-1，3.56 μg/ mL-1and 0.95 μg/mL-1，respectively.chlorogenic acid，forsythosides A and total polysaccharides are the highly possessed content in Jinying Huanggui and can be used as quality control index.

Jinying Huanggui preparation；Ultraviolet spectrophotometry；High performance liquid chromatography（HPLC）；Effective composition analyze

HE Jun

S853.9

A

0529-6005（2016）07-0047-05

2015-07-07

国家自然科学基金项目（31260618）

周送桂（1990-），女，硕士，研究方向为天然药物化学，E-mail：565345638@qq.com

何珺，E-mail：hejun1016@163.com