咪达唑仑对山羊不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

郑　宇，李　德，潘佳亮，高　利

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

咪达唑仑对山羊不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

郑宇，李德，潘佳亮，高利

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

为研究咪达唑仑对山羊不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响，探讨其在中枢麻醉的作用机制。试验用15只健康山羊，3只为生理盐水对照组，其余为试验组，试验组山羊肌肉注射14 mg/kg体重咪达唑仑。分别在给药后诱导期、麻醉期、恢复Ⅰ期和恢复Ⅱ期4个时间点，每点剖杀3只山羊取脑组织，采用分光光度法测定不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。结果注射咪达唑仑能明显抑制山羊大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，这种变化趋势与山羊肌肉注射咪达唑仑麻醉后行为学变化基本一致，海马的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在整个麻醉过程中无明显变化。表明咪达唑仑的麻醉作用可能与抑制山羊大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相关。

Ca2+-Mg2+-ATP酶；山羊；咪达唑仑

Ca2+-Mg2+-ATP酶（又称钙泵），是细胞膜上一种重要的酶，在维持细胞内Ca2+和Mg2+浓度稳定，神经细胞动作电位的传导、心肌及其他肌肉的收缩、细胞的分泌和繁殖方面均有重要影响[1-2]。咪达唑仑（Midazolam、Dormicum）是苯二氮卓类麻醉剂，具有抗焦虑、镇静、安眠、肌肉松弛、抗惊厥作用[3]。曾经有过关于复合麻醉剂对猪Ca2+-Mg2+-ATP酶的影响的相关报道，也有关于咪达唑仑对山羊中枢麻醉机制的研究，但到目前为止，咪达唑仑麻醉山羊时对山羊不同脑区的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响还没有报道。本实验针对咪达唑仑麻醉对山羊各个脑区进行研究，以了解咪达唑仑麻醉山羊时各脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的情况，探讨咪达唑仑对山羊麻醉的中枢机制及其在中枢神经系统的相关作用位点。

1　材料与方法

1.1试验动物8月龄健康山羊15只（购自哈尔滨郊区养殖户，医学检查健康），体重13～15 kg，雌雄兼用（雌性7只，雄性8只），试验前在动物舍喂养1周以适应环境。试验前12 h禁食禁水。

1.2仪器和药品AvantiTM30Centrifuge高速冷冻离心机，购自Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM多体积分光光度计，购自美国伯腾仪器有限公司；咪达唑仑注射液，由哈尔滨医科大学提供；ATP酶测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.3动物分组及样品采取15只山羊随机分为两组：对照组（生理盐水组）3只、试验组12只，其中试验组按照给药后测定时间分为麻醉诱导组（注药后5 min）、麻醉组（翻正反射消失）、恢复Ⅰ组（翻正反射恢复时）、恢复Ⅱ组（翻正反射恢复后6 h）4个时间点每个时间点3只。对照组与麻醉组分别肌肉注射生理盐水1.5 mL/kg体重，咪达唑仑14 mg/kg体重，于各时间点处死山羊开颅，取脑组织，用4℃生理盐水冲净脑组织附着的血液，置于冰面上迅速分取双侧大脑皮层、小脑、丘脑、脑干和海马。称重后按1∶9（W/V）置入预冷的生理盐水溶液中匀浆，然后3000 r/min（-4℃）高速离心10 min，取上清液。行为学变化分组标准按照师铭咸等[5]所述标准判定。

1.4检测方法采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，比色法测定ATP酶催化分解ATP生成的无机磷。

2　试验数据的分析与统计

本试验Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影响的检测结果应用SPSS 13.0 for Windows数据统计分析软件，对数据进行一维方差分析，对照组与试验组变量间简单相关分析采用直线相关回归分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。应用Micro⁃soft Excel 2007对试验数据进行作图。

3　试验结果与分析

3.1咪达唑仑麻醉下山羊行为学变化试验组山羊注药后表现逐渐安静，行动迟缓，共济失调，趴卧不动，最后翻正反射消失。翻正反射平均消失时间为8.46±2.67 min。在麻醉期间，山羊眼半闭，眼球向内下方翻转，对光反射存在。眼睑反射、角膜反射明显减弱，肛门反射存在，较少出现流涎。翻正反射恢复的平均时间为45.68±4.52 min；而对照组无明显行为学变化。

3.2咪达唑仑麻醉对山羊脑组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影响的检测结果见表1。

表1　咪达唑仑麻醉对山羊不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响　（n=3，±SD）

表1　咪达唑仑麻醉对山羊不同脑区Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响　（n=3，±SD）

**：与对照组比较P<0.01，差异极显著；*：与对照组比较P<0.05，差异显著；▲▲：与麻醉期比较P<0.01，差异极显著；▲：与对照组比较P<0.05，差异显著

大脑　海马　丘脑　小脑　脑干对照组　5.37±0.36　4.17±0.16　5.18±0.52　3.87±0.69　4.14±0.50诱导期　4.57±0.76　4.05±0.44　4.29±0.65*　2.78±0.84*　3.46±0.45▲▲麻醉期　3.94±0.53*　3.49±0.34　3.56±0.32**　2.15±0.14**　2.16±0.27**恢复Ⅰ期　4.21±0.37*　3.67±0.75　4.77±0.22▲▲　3.27±0.34▲　3.04±0.18*▲恢复Ⅱ期　4.67±0.62　4.09±0.42　5.16±0.38▲▲　3.50±0.35▲　3.92±0.63▲▲

如表1所示，在咪达唑仑麻醉过程中，山羊海马区域的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性无明显变化。大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显受到抑制。在诱导期，大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与对照组比较，分别降低14.9%（P> 0.05）、17.2%（P<0.05）、28.2%（P<0.05）和16.4%（P> 0.05），差异不显著或显著。麻醉期大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明显抑制，与对照组比较，分别降低26.6%（P<0.05）、31.3%（P< 0.01）、44.4%（P<0.01）和47.8%（P<0.01），差异显著或极显著。恢复I期丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显恢复，与麻醉期比较，分别升高34.0%（P<0.01）、52.1%（P<0.05）和40.7%（P<0.05），差异显著或极显著，大脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性仍受到明显抑制，与对照组比较差异显著（P< 0.05），恢复II期上述脑区的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢复到对照组水平，大脑的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与麻醉期比较差异不显著（P>0.05），小脑的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与麻醉期比较差异显著（P<0.05），丘脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与麻醉期比较差异极显著（P<0.01）。大脑、丘脑、小脑和脑干的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化趋势与山羊行为学变化相平行（基本吻合），海马的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化趋势与山羊行为学变化相比较，没有规律。

4　讨论

Ca2+-Mg2+-ATP酶，也称Ca2+泵或Ca2+-ATP酶。中枢神经系统对Ca2+浓度的调节除通过各型Ca2+通道外，主要是通过Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+这两个机理维持细胞内Ca2+稳态[2]。Ca2+在神经传导、肌肉收缩、细胞分泌和增殖、形态发生、细胞老化等许多细胞反应过程中都有调节作用。脑细胞膜上存在的Ca2+-Mg2+-ATP酶能不断将进入细胞内的Ca2+逆电化学梯度泵出至细胞外，使细胞内Ca2+浓度保持稳定状态，维持正常的细胞功能[5]。细胞的多种功能都依赖于细胞内外极高的Ca2+浓度差存在（胞外Ca2+浓度大约比胞内高出10 000倍），一旦这种浓度差减低，细胞就会受到功能性损伤，甚至引起死亡。Ca2+-Mg2+-ATP酶能够直接利用ATP为能源，逆浓度梯度主动的把细胞内液的Ca2+泵出膜外，以维持胞内Ca2+的低稳态，从而保证神经细胞的正常兴奋性[6]。有研究表明，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低必然影响胞浆和胞内Ca2+稳态，导致胞内Ca2+的蓄积[Ca2+]i升高，从而影响神经细胞动作电位的产生与兴奋性传导，产生一定的中枢抑制效应[7]。

本试验结果表明，肌肉注射咪达唑仑后，随着翻正反射的消失，山羊大脑、丘脑、小脑和脑干内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均受到明显抑制，待翻正反射恢复并能自由走动后，上述脑区内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性基本恢复到正常水平，这种变化趋势与山羊的行为学变化相平行。而在麻醉过程中，山羊海马内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，未发生明显变化。分析试验结果推断，大脑、丘脑、小脑和脑干内Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪达唑仑全麻作用的靶位之一，且咪达唑仑全麻作用可能与抑制这些脑区内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性相关。

Buljbasic N等研究发现，咪达唑仑对犬心肌细胞K+通道中的ICa产生一个剂量依赖性抑制[8]。这一研究表明，咪达唑仑可以抑制胞内游离Ca2+泵出胞外，这可能是由于Ca2+，Mg2+-ATP酶活性受到抑制的结果，与本试验的结果一致。

5　结论

本试验结果表明，咪达唑仑可抑制山羊大脑、丘脑、小脑和脑干内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。山羊上述脑区的Ca2+-Mg2+-ATP酶可能是咪达唑仑全麻作用的靶位之一。

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[8]Buljubasic N，Marijic J，Berczi V，et al.Differential effects of etomidate，propofol，and midazolam on calcium and potassium channel currents in canine myocardial cells[J].Anesthesiology，1996，85（5）：1092-1099.

Effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzymeactivity in different encephalic regions of goats

ZHENG Yu，LI De，PAN Jia-liang，GAO Li
（College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme activity in different brain regions of goats and to ex⁃plore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscular injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were ex⁃ecuted in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after in⁃duction，respectively，and there brain tissues were taken immediately.Spectrophotometric method was used to determine the activi⁃ty of Ca2+-Mg2+-ATP in different brain regions of goats.midazolam significantly inhibited Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cere⁃brum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem，but there were no significant changes of Ca2+-Mg2+-ATP activity in the hip⁃pocampus.The results indicate that the narcotic effect of midazolam may be related to the inhibition of Ca2+-Mg2+-ATP activity in goats’cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem.

midazolam；Ca2+-Mg2+-ATP enzyme；goat.

GAO Li

S858.27

A

0529-6005（2016）07-0016-03

2015-06-18

国家自然科学基金（31372491）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C2011B）；黑龙江省教育厅面上项目（12531016）

郑宇（1990-），女，硕士，研究方向为临床兽医学，E-mail：1226733062@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com