三周游泳训练对小鼠肝线粒体蛋白质组的影响*

刘 璐 刘祥梅 文登台 施 孟

(湖南师范大学体育学院, 湖南 长沙 410012）

三周游泳训练对小鼠肝线粒体蛋白质组的影响*

刘 璐 刘祥梅 文登台 施 孟

(湖南师范大学体育学院, 湖南 长沙 410012）

目的:应用双向凝胶电泳和质谱技术研究三周轻负重游泳训练对小鼠肝线粒体蛋白质组的影响。方法:20只雄性ICR小鼠分为安静对照组(C)和游泳训练组(TB)。TB组三周轻负重游泳训练后48 h 和C组小鼠均取材，提取肝线粒体蛋白质做双向凝胶电泳并分析，取差异表达10倍以上的蛋白点。质谱检测结果：C组和TB组差异蛋白表达上调5倍以上的有25个，下调5倍以上的有6个，上调10倍以上的有5个，下调10倍以上的有1个；质谱鉴定出结构明确的三种蛋白为热休克蛋白60、乙醛脱氢酶2和细胞色素b-c1复合体1。结论：三周轻负重游泳训练小鼠肝线粒体蛋白质组差异表达明显，突出地对保护线粒体和加强能量代谢电子传递过程的蛋白表达上调，这与适宜运动有利于肝脏的关系密切。

游泳;肝线粒体;蛋白质组学;小鼠;动物实验

肝脏是人体内最大腺体和功能最复杂的器官之一，对糖、蛋白质、脂类、维生素和激素的代谢起重要作用，肝脏的机能影响着机体的运动能力，而运动可改变肝脏的结构和功能。运动与肝脏的相互影响的过程中，肝线粒体的结构和功能变化是重要原因[1]。线粒体功能最终由蛋白质执行，其蛋白质组的研究在揭示疾病发病机制和治疗信息中日益受到关注[2]。适宜运动对肝细胞有保护作用与减少线粒体能量损耗及损伤有关[3]。本实验采用二维电泳和质谱技术分析轻负重游泳训练三周后的肝线粒体蛋白质组差异表达及发挥特殊生物学意义的重要蛋白，探讨运动对肝脏影响的线粒体机制，为应用合理运动对肝脏保健与促进疾病康复提供分子生物学新依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与训练方案

20只雄性 ICR小鼠，体重 30±2 g，按体重分层随机分为安静对照组(C)和游泳训练组(TB)。TB组放入水温28±2 ℃、水深 40 cm的桶内游泳，一周不负重 30分钟，二周尾根部2%负重40分钟，三周3%负重40分钟。每周五天，进行三周。

1.2 取材与样品制备

TB组训练48 h后，与C组均称重麻醉，摘取右肝前叶，提肝细胞线粒体蛋白并组内合并上清后蛋白定量，每管浓度1 mg 分装，保存在-80℃超低温冰箱中备用。

1.3 固相PH梯度-SDS双向凝胶电泳及图谱分析

取待测样品加水化液至 350μl后进行一项等电聚焦，结束后进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。考马斯亮蓝G-250染色过夜并清洗。用清华紫光D3000图像扫描仪扫描凝胶。软件 Bio-rad PDquest分析差异蛋白并取差异10倍以上点做质谱检测。

1.4 MS（质谱）鉴定

用取点器将候选蛋白质点切下，去离子水反复冲洗10 min，置于EP管中，移液枪吸尽水分。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行酶解后 MALDI-TOF-TOF质谱检测肽质量指纹谱和通过 Mascot查询 NCBInr数据库鉴定蛋白质。查询参数：物种来源小鼠；胰蛋白酶水解；酶解片段不完全选择为1；肽片段相对分子质量最大允许误差控制在±0.1Da。

2 结果

2.1 2 -DE图谱分析结果

每组进行 3次电泳。分析扫描图，两组间并无缺失和新增蛋白点，差异蛋白点共 233个，5倍以上有 25个，10倍以上有6个。上调5倍以上的蛋白点有19个；下调5倍以上的点有6个。差异蛋白10倍以上点有5个上调和1个下调（见表1）。

表1 游泳训练后小鼠肝线粒体差异10倍以上的蛋白点

2.2 MS质谱鉴定结果

差异表达10倍以上的蛋白点进行肽质量指纹图谱(PMF)分析，结果通过Mascot查询NCBInr数据库，鉴定出三个在线粒体表达上调的蛋白：热休克蛋白60

（HSP60）、乙醛脱氢酶（ALDH）和细胞色素b-C1复合物亚基1（QCR1）（见表2）。1903号点的127号肽段其氨基酸序列为HSP60的特定序列269-290（R.KPLVIIAEDVDGEALSTLVLNR.L），其得分165；4704号点的152号肽段其氨基酸序列为ALDH2的特定序列229-259（K.EAGFPPGVVNIVPGFGPTAGAAIASHEGVDK.V），其得分121；2602号点的126号肽段其氨基酸序列为QCR1的特定序列397-415（R.NALVSHLDGTTPVCEDIGR.S），其得分151（见图2）。

表2 MS（质谱）鉴定结果

图2 蛋白点质谱图

3 讨论

线粒体是真核细胞的重要细胞器，其合成的 ATP能为细胞生命活动提供直接能量，在各种生理病理过程中发挥着至关重要的作用。已有研究报道，适宜运动可减少线粒体能量损耗及氧化损伤，保护肝脏[4]。8周的训练可减轻情绪应激大鼠肝线粒体氧化应激[5]。然而，运动训练机体肝线粒体差异蛋白质组表达和分析少有研究报道。本实验显示，差异表达10倍以上的蛋白点将在线粒体中发挥重要作用，继而显著影响到所在组织器官细胞的功能。质谱鉴定出上调 10倍以上的肝线粒体蛋白有HSP60、ALDH2和 QCR1，显然游泳训练使机体肝细胞将受到这三种蛋白特殊生物学作用的突出影响。

热休克蛋白（HSP）为应激蛋白，是结构上高保守的多肽，生物细胞受高温、病原体或其他损伤因素的应激刺激后发生热休克反应所产生的一组蛋白质。本身不直接发挥作用，而通过改变或修饰其他蛋白并影响或调节结构与功能，间接发挥作用 。其中，HSP60为14个亚单位组成的寡聚体,主要存于线粒体中，在细胞质基质与线粒体之间的物质转运过程中十分重要[6]。本研究三周轻负重游泳训练后 HSP60表达上调，显然肝线粒体发生了运动适应和提高了应激能力,对肝细胞抗损害和维持正常功能有利，说明三周轻负重游泳训练可能通过保护线粒体继而发挥保护肝脏作用。

乙醛脱氢酶(ALDH)是醛类氧化酶，是酒精在体内代谢的关键酶。ALDH2是一种由染色体 12q24 编码的四联体蛋白，其在核中编码后由 17-氨基酸 N-末端线粒体定位序列共翻译转运至线粒体基质。已有研究报道证实心脏保护过程中 ALDH2起到重要作用[7]。本研究中显示，ALDH2表达增加,显然游泳训练后其在线粒体的相关生物学功用加强，肝线粒体及细胞将受到保护。

细胞色素b-c1复合体是一个多亚基的膜蛋白复合体，分布于线粒体膜、线粒体电子传递链和细胞膜。在线粒体呼吸电子传递链其处于中点。既往运动机体具体到肝细胞线粒体QCR1表达变化不详，本实验显示三周游泳训练小鼠肝线粒体中其表达增加，线粒体呼吸链电子传递过程将加强,势必利于肝脏及机体能量供应，起到提高肝细胞和身体功能水平作用。

4 结论

三周轻负重游泳训练小鼠与控制对照组肝线粒体差异表达蛋白点233个，5倍以上的差异点25个，10倍以上差异蛋白点6个，质谱鉴定出上调10倍以上的三种肝线粒体蛋白为HSP60、ALDH2和QCR1，揭示三周轻负重游泳训练重点改善了线粒体保护机制和加强了能量代谢电子传递过程。提示，适宜运动对肝脏有益的机制与肝线粒体蛋白质组差异表达有关，且HSP60、ALDH2和QCR1突出地发挥了生物学作用。

[1] Venditti P, Masullo P, Meo SD. Effect of exercise duration on charac－teristics of mitochondrial population.from rat liver[J].Arch Biochem Biophys, 1999,368(1):112-120.

[2] Musicco C, Capelli V, Pesce V, et al. Rat liver mitochondrial proteome: changes associated with aging and acetyl-L-carnitine treatment[J].J Proteomics,2011,74(11):2536.

[3] Gonçalves IO, Passos E, Rocha-Rodrigues S, et al. Physical exercise prevents and mitigates nonalcoholic steatohepatitis-induced liver mitochondrial structural and bioenergetics impairments[J]. Mitochondrion,2014,08:1540.

[4] Rosety-Rodriguez M, Ordonez FJ, Rosety I, et al. 8-weeks training program attenuates mitochondrial oxidative stress in the liver of emotionally stressed rats[J].Histol Histopathol2006,21(11): 1167.

[5] Li L , Lu DZ , Li YM, et al. Proteomic analysis of liver mitochondria from rats with nonalcoholic steatohepatitis[J].World Gastroenterol,2014,20(16):4778.

[6] Wang W, Mohsen AW, Uechi G, et al. Complex changes in the liver mitochondrial proteome of short chain acyl-CoA dehydrogenase deficient mice[J]. Mol Genet Metab,2014,112(1):30.

[7] Oshima R , Nakano H , Katayama M, et al. Modification of the hepatic mitochondrial proteome in response to ischemic preconditioning following ischemia-reperfusion injury of the rat liver[J]. Eur Surg Res 2008,40(3):247.

Effects of Swimming Training for 3 Weeks on the Liver Mitochondrial Proteome of Mice

LIU Lu, et al.
（PE College of Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan, China）

[Objective]The technologies of two dimensional gel electrophoresis and mass spectrum were used to study the effects on liver mitochondria proteome of mice with three week swimming training. [Methods] Totally 20 ICR male mouse divided into control group(C) and swimming training group(TB). The TB group by light weight after 48 hours and C group were killed and the total protein of liver was determined by two dimensional gel electrophoresis separation and analyzing image and collecting data. Mass spectrum was more than 10 times Protein Spots in the two groups. [Results] There are 25 increased expression more than 5 times and 6 decreased expression.5 increased and 1 decreased more than 10 times. Protein spots of differential expression more than 10 times were selected as object protein in MS identification and three indicating proteins were identified as HSP60, ALDH and QCR1. [Conclusions] Expression of Liver mitochondria proteins in mice were differential after three week of swimming training，and increase the expression which may be the key that appropriate exercise is beneficial to the liver.

swimming; liver mitochondria; protein proteomics; mice; animal experiment

湖南省自然科学基金资助项目（11JJ3111），湖南师范大学"运动促进人口健康协同创新中心"课题（13ycrjxcz004）。

刘璐（1989-），山西临汾人，研究生，研究方向：体育保健养生。