文蛤抗肿瘤蛋白M ere15的表达纯化及鉴定

乔淦

（青岛科技大学化工学院，山东青岛　266042）



文蛤抗肿瘤蛋白M ere15的表达纯化及鉴定

乔淦

（青岛科技大学化工学院，山东青岛266042）

抗肿瘤蛋白Mere15是从海洋生物文蛤中获得的抗肿瘤多肽。前期研究表明，Mere15具有显著的体内外抗肿瘤活性，但其在文蛤体液中含量极低。利用简并引物技术克隆了Mere15的全基因序列，并在大肠杆菌中获得高效表达。利用亲和层析技术纯化目的蛋白，经透析除去盐和超滤浓缩，获得Mere融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白分子量为33 kDa。MTT结果表明，目的蛋白对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用，为海洋抗肿瘤蛋白研究提供了新的思路，对抗肿瘤新药Mere15的开发应用也有一定的价值。

文蛤；抗肿瘤多肽；重组表达；细胞毒活性

文蛤（Meretrix meretrix） 作为一味传统中药，在《伤寒杂病论》及《百草纲目》等记载文蛤具有活血化瘀、防寒止痛的功效。目前，从文蛤分离的化合物有多糖、糖肽、脂质、牛磺酸、多肽等［1-7］；文蛤提取物具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗炎、增强免疫等生物活性［2，8-17］。文蛤多肽类的抗癌活性研究中，范成成等人［18］提取的一种文蛤多肽Mer2具有广谱的癌细胞抑制活性，调控癌细胞的凋亡、抑制癌细胞的生长。在本试验前期分离的1种文蛤多肽Mere15［19］，通过多通路诱导肺癌细胞A549凋亡文蛤多肽抑制肿瘤细胞微管蛋白聚合。Mere15可以抑制微管蛋白的聚合，调控细胞周期蛋白的表达，阻滞细胞周期的正常发生，在多肽作用下肺癌细胞在G2/M时期停滞，抑制肺癌细胞的生长并促进细胞凋亡。

本试验通过对Mere15多肽进行Edama降解法测序，测得一段序列。通过简并引物技术克隆了Mere15相关基因，构建工程菌，表达Mere15融合多肽，并研究了其对癌细胞的细胞毒作用。

1　材料与方法

1.1材料

文蛤，购买自青岛河套海洋渔业发展有限公司；克隆载体Puc-19和表达载体Pet-28a，均购买自大连Takara公司；感受态菌株Top10和表达菌株BL21，均购买自全式金生物公司；总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Fast HiFidelity PCR Kit聚合酶、胶回收试剂盒，均购买自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶、连接酶，均购买自NEB；反转录试剂盒、PCR试剂，均购买自Takara公司；PVDF膜，购自Milipore；抗-His抗体、羊抗鼠二抗及DNA Mark2000，均购买自碧云天生物技术有限公司；5 mLNi-NTA His Bind column，购买自GE公司；透析袋，购买自Sigama公司；其他常用化学用品均购买自国药集团。

1.2方法

1.2.1抗肿瘤多肽Mere15基因克隆

Mere15 N端序列测定采用Edama降解法，由上海生工公司完成。文蛤总RNA提取，使用1 mL TRIZOL buffer处理文蛤组织，然后离心分离，按照试剂盒说明进行操作，最终使用TE buffer重悬RNA。以RNA模板合成cDNA，反应体系参数按照反转录试剂说明书进行，反应条件为42℃，15 min；85℃，30 s终止试验。Mere15基因合成使用简并引物技术，根据Mere15多肽序列比对分析结果，使用CODEHOP软件设计简并引物［20-21］。

M1：5'CGCCGAATTCATGGTNGTNTGYCCNGAY G3'；

M2：5'CCGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'

（R=A+G；Y=T+C；N=A+T+C+G；）

引物由上海生工合成，EcoRI及HindIII双酶作为酶切设计用于载体构建。Mere15基因克隆以cDNA为模板，反应体系按照PCR反应说明书要求进行，反应条件按照Perkin Elmer的方法：94℃，2 min；94℃，15 s，58℃，10 s，68℃，30 s，共35个循环；68℃延伸5 min，获得Mere15基因全长序列。将获得条带经胶回收，纯化得到目的基因片段。

1.2.2表达载体构建

将目的基因与T载体（PUC19-Mere15），试验方法按照载体说明书操作。构建好的克隆质粒转染大肠杆菌DH5α，进行质粒扩增，采用胶回收的方法纯化PUC18-Mere15质粒，测序验证后将目的基因插入表达载体PET28，获得表达载体成PET28-Mere15。

1.2.3Mere15融合蛋白诱导表达与纯化

使用Ni离子亲和柱（GE，Ni-NTA His Bind column）纯化Mere15融合蛋白。PET28-Mere15质粒转化BL21宿主菌，接种重组子在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中筛选阳性克隆，培养过夜。接种阳性重组子至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，待菌体生长至对数期（OD=0.8）左右，使用1 m MIPTG，37℃，220 r/min诱导目的蛋白表达，4 h后高速离心收集菌体。使用100 mLLysis buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值8.0） 重悬菌体，加入1 mmol/L苯甲基磺醯化氟、1%NP40及适量溶菌酶，进行超声破碎细胞（工作2 s，暂停1 s），至细胞完全破碎，然后高速离心（12 000 r/min，10 min），取上清。经Ni离子亲和柱亲和纯化，上样过程中收集穿透液（如图2 A1），后使用15 mL Washing buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脱并收集杂蛋白（如图2 A2）。使用20mL Elution buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脱并收集目的蛋白（如图2 A3），然后使用SDS-PAGE鉴定蛋白表达纯化。

1.2.4Mere15融合蛋白鉴定

取适量目的蛋白，使用15%SDS-PAGE凝胶电泳，电转至0.45 μm PVDF膜，后使用5%小牛血清封闭PVDF膜1 h后，加入适量HIS抗体稀释液（1∶1 000），4℃层析柜中孵育过夜，TBST（19 mmol/L Tris-HCl，2.7 mmol/L KCl，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20，pH值8.0）缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次5 min，然后加入适量过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室温孵育1 h后，使用TBST漂洗膜3次，每次5 min。使用ECL化学发光的方法检测融合蛋白印迹。

1.2.5MTT法测定细胞抑制率

取对数期细胞A549及PNC28，然后细胞密度稀释至2×104个，按照每孔190 μL接种于96孔板，培养24 h；然后加入10 μL的重组蛋白，按照20，40，80，160 μg/mL的最终浓度加入各孔，空白组加入10 μL培养基，每组设3个复孔。置于5%CO2，37℃条件下培养24 h，然后在显微镜下观察细胞形态并记录，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。放入细胞培养箱中4 h后，弃去培养基，加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），水平振荡10 min；然后使用酶标仪测定各孔于570 nm处吸光度，每组取平均值计算多肽对细胞的抑制活性。

2　结果与分析

2.1目的基因鉴定

分子印迹检测见图1。

图1　分子印迹检测

使用简并引物技术扩增目的基因，根据Mere多肽的N端序列，经数据库Blast比对得到Mere同源蛋白序列，然后根据简并引物设计原则克隆目的基因。目的基因扩增结果如图1 A所示，目的基因片段在850 bp左右，通过比对PET-Mere15序列与Mere15蛋白测序结果，确定其序列一致，重组子构建符合设计。PUC19-Mere15载体的双酶切如图1 B，表达载体PET28-Mere15的双酶切凝胶如图1 C，目的基因在850 bp左右，和克隆基因的分子大小一致，符合预测值。而天然分离的Mere15分子大小在15 kDa左右，融合的大小则为33 kDa。理论上，融合蛋白只增加了6个组氨酸标签并没有改变蛋白序列，蛋白之间差异可能是Mere15 RNA剪接发生而产生分子量不同的蛋白。

2.2Mere15多肽表达纯化

蛋白纯化系统纯化过程1，2，3样品吸光度见图2，3样品SDS-PAGE结果见图3，免疫印迹蛋白见图4。

图2　蛋白纯化系统纯化过程1，2，3样品吸光度

图3　3样品SD S-PAG E结果

图4　免疫印迹蛋白

结果表明，目的蛋白主要存在于包涵体中，超声破碎包涵体以获得目的蛋白。使用Ni离子柱对目的蛋白进行亲和纯化，蛋白纯化流程如图2，其中穿透液（1）、杂蛋白洗脱液（2）、目的蛋白洗脱液（3）。由图3可知，目的蛋白的分子大小在33 kDa左右，和预计结果一致。从结果中可以看出，目的组分中有少许杂蛋白，但目的产物纯度为95%以上，杂蛋白对蛋白影响较小，目的蛋白可以用于细胞活性测定。由图4可知，在33 kDa大小左右有1条明显印迹条带，说明有融合蛋白成功表达。使用超滤设备对目的蛋白浓缩除盐，最终使用PBS缓冲溶液稀释Mere15融合蛋白至5 mg/mL。

2.3重组蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用

24 h后A549细胞形态变化见图5，24 h后PNC28细胞形态变化见图6。

图5　24 h后A549细胞形态变化

图6　24 h后PN C 28细胞形态变化

采用MTT法测定了重组蛋白对A549及PNC28生长的抑制作用，蛋白多肽对2种细胞的抑制活性在160 μg/mL质量浓度下抑制率分别为43.7%，44.6%。在多肽处理24 h后，显微镜下观察细胞形态如图5和图6，空白组的细胞形态呈紧密排列，状态良好，而随着蛋白质量浓度的升高，细胞的形态出现了变化，多肽质量浓度越高细胞状态变化越大。细胞由规则的形态逐渐变化为体积缩小直至成为细胞碎片，细胞胞浆固缩并出现明显的空泡状结构。细胞之间的空隙逐渐增大，贴壁能力变弱，呈现一定的凋亡特征，说明多肽对癌细胞具有一定的抑制作用。多肽的抑制活性随着蛋白质量浓度梯度增加，说明药物活性和多肽质量浓度有较强的依赖关系。

3　讨论

多肽生物活性的研究中，多数多肽表现出一定的抗肿瘤活性，如赵进［22］发现的海鞘多肽CS5931，通过作用于细胞表面的烯醇化酶（Enolase） 相互作用，抑制Enolase的活性，从而抑制癌细胞的正常代谢功能，诱导细胞凋亡。阮之平等人［23］分离出一种蟾蜍多肽的试验表明，蟾蜍活性多肽可能通过下调周期相关基因cyclin B，CDK1的表达阻滞肿瘤细胞周期于G2/M期检查点。对凋亡诱导的作用可能与凋亡相关基因Survivin，Caspase-3表达和bcl/bak表达的比值上调有关。另外，庄海峰等人［24］分离的一种蝎毒多肽对急性淋巴癌细胞的研究中，结果表明蝎毒多肽可有效抑制HL-60细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，其机制可能是多肽参与HL-60细胞内p53基因的表达调控，抑制Bcl-2基因的表达有关。

Mere15是一种从文蛤分离天然多肽，在前期研究中文蛤多肽具有靶向调控肺癌细胞凋亡的作用，在Mere15多肽处理癌细胞后，细胞周期停滞在G2/M期，阻滞细胞周期的正常发生，并通过调控细胞周期蛋白p21的表达及抑制微管蛋白的聚合，从而抑制细胞正常代谢及有丝分裂功能，促进细胞凋亡的发生。本试验中克隆的Mere15相关基因约为使用原核表达的方法得到Mere15的融合蛋白，Mere融合蛋白大小约为33 kDa左右，与分离的天然文蛤蛋白Mere15分子量有一定差异，分离的 Mere多肽在45 μg/mL的抑制活性为77%，而表达的融合蛋白细胞活性（43.6%）降低，产生这个结果的原因可能是融合蛋白的分子量较大，蛋白的结构改变掩盖了蛋白的活性位点。天然多肽可能是由融合多肽基因剪接而得到的一种小分子多肽。目前的试验表明，大分子Mere15融合多肽具有一定的抑癌活性，下一阶段将对融合蛋白的基因截取小片段后再融合表达，通过研究小片段多肽活性及机制，寻找抗癌药物的新靶点。

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Cloning Experession and Cytotoxicity of Antitumor Protein from Meretrix Meretrix

QIAO Gan
（Colege of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao，Shandong 266042，China）

In the precious study，an antitumor protein，called Mere15 is isolated form Meretrix meretrix.The polypeptide could effectively inhibit the cancer proliferation both in vitro and in vivo.However，the content of the polypeptide in the species is very low.In the present study，the cDNA sequence is cloned and the polypeptide is expressed in E.coli.The antitumor protein is purified to homogeneity with molecular 33 kDa.MTT assay revealed that the recombinant protein displayed potent cytotoxicity to several cancer cells.The study develop an novel strategy for the production of antitumor protein from marine organisms，and the work is also important for developing Mere15 as an novel anticancer agent.

Meretrix meretrix；anticancer protein；cloning and expression；cytotoxicity

G420

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.013

1671-9646（2016）07a-0044-04

2016-05-09

国家自然科学基金（81573457）。

乔淦（1989— ），男，硕士，研究方向为生物药物。