黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影响*

苏　韫，刘永琦，颜春鲁，薛　娜，伍志伟，聂　蕾，王　琰甘肃中医药大学，甘肃兰州73000；甘肃省妇幼保健院



黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠
脑组织Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影响*

苏韫1，刘永琦1，颜春鲁1，薛娜1，伍志伟1，聂蕾1，王琰2
1甘肃中医药大学，甘肃兰州730020；2甘肃省妇幼保健院

目的：探讨黄芪多糖对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织Bcl-2、Bax蛋白及NO含量的影响。方法：将SPF级Wistar大鼠72只分为假手术组、模型组、阳性对照组及黄芪多糖高、中、低剂量组，采用改良的线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型，各药物组分别给予相应药物15天后采用免疫组化法检测Bax、Bcl-2蛋白含量的表达，采用硝酸盐还原酶法检测NO蛋白含量的表达。结果：1）Bcl-2、Bax的含量模型组较假手术组表达明显增加；与模型组比较，Bcl-2表达黄芪多糖高、中剂量组增加（P＜0.05）；Bax含量黄芪多糖高剂量组表达显著减少（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组Bc l-2/Bax比值明显降低，阳性对照组与黄芪多糖各剂量组比较比值升高。2）与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中NO的水平明显升高（P＜0.05），与模型组比较，黄芪多糖高剂量组中NO含量明显降低（P＜0.05）。结论：黄芪多糖可增加凋亡抑制基因Bc l-2蛋白和降低凋亡促进基因Bax蛋白的表达，通过增加Bcl-2/Bax比例，降低NO含量，减少细胞凋亡的凋亡程度。

脑缺血再灌注；Bcl-2；Bax；NO；黄芪多糖

脑缺血再灌注后发生细胞凋亡是一个由多个基因严格控制的程序性死亡过程，其中Bcl-2基因和Bax基因是一对抑制细胞凋亡、促进凋亡的重要基因，目前普遍认为，Bcl-2家族中抑制细胞凋亡的因子与促进细胞凋亡的因子之间的比例决定着细胞的生死［1-2］。本研究通过探讨黄芪多糖对大鼠脑缺血再灌注后脑组织Bcl-2、Bax表达、Bcl-2/Bax比值及NO含量的影响，推测黄芪多糖可能的药理作用机制，为临床用药提供理论基础。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级Wistar大鼠72只，体质量（300±30）g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物实验设施使用证号：SYXK（甘）2011-0001，实验动物质量合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001343。

1.2主要试剂浓缩型兔抗大鼠Bcl-2抗体：BA0412（武汉博士德生物工程有限公司）；浓缩型兔抗大鼠Bax抗体：BA0315（武汉博士德生物工程有限公司）；SABC（兔IgG）免疫组化试剂盒（SA1022，武汉博士德生物工程有限公司，批号：201203）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：201203）。

1.3实验药物选用甘肃道地药材黄芪，黄芪多糖由甘肃中医药大学科研实验中心药物制剂实验室提取、分离、鉴定；尼莫地平（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：110810）；青霉素（华北制药股份有限公司，批号：110912）。

1.4主要仪器C X31型生物显微镜（日本Olympus optical Co.LTD）；山东易创MiE图像处理系统（山东易创电子有限公司）；成都泰盟BI-2000医学图象分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.5实验方法

1.5.1动物分组将Wistar大鼠72只随机分为6组，即假手术组、模型组、阳性对照组及黄芪多糖高、中、低剂量组，每组12只。

1.5.2给药剂量及方法黄芪多糖给药剂量：高剂量120mg/kg；中剂量60mg/kg；低剂量30mg/kg；配药浓度：高剂量组1.2%，中剂量组0.6%，低剂量组0.3%。临用前分别用助溶剂0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成相应浓度的溶液。尼莫地平给药剂量为5mg/kg，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制。模型组和假手术组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，各组造模后分别连续给药15天。

1.5.3动物模型制备及取材采用Logna EZ等［3］报道的线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型。自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线约（18.5±0.5）mm，阻断大脑中动脉血流，造成局灶性脑缺血。术后将栓线尾部置于皮下，于2小时后小心抽出栓线实现缺血再灌注。假手术组颈内动脉也插入栓线，但深度仅为6mm，不阻塞大脑中动脉。麻醉清醒后参照Longa EZ［3］方法进行5分制评分，达1～3分入组。术后腹腔注射青霉素钠盐，每天40000U，连续注射3天，以预防感染。造模后24小时对大鼠神经功能进行评分，参考Longa及Bederson［4］评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分，评分为1～3分者提示模型成功；10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取右脑并用4%多聚甲醛溶液4℃固定，制备蜡块后免疫组化法检测Bax及Bcl-2蛋白，将制备病理标本剩余右脑组织制备组织匀浆检测N O的含量。

1.5.4图像分析Bcl-2、Bax阳性细胞表达为棕黄色，主要位于胞浆、包膜上；随即选取缺血侧皮层5个视野；每组观察6张切片，合计30个视野；阳性细胞计数，计算平均值。

1.6统计学方法数据采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以（χ±s）表示，进行单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2、Bax表达的影响假手术组Bcl-2仅有少量细胞阳性表达，模型组较假手术组Bcl-2阳性表达增加（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组Bcl-2阳性表达增加，黄芪多糖高、中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；假手术组Bax仅有极少量的阳性表达，模型组较假手术组Bax表达增加（P＜0.05）。与模型组比较，黄芪多糖高剂量组表达减少（P＜0.05）。与假手术组比较模型组Bcl-2/Bax比值降低，阳性对照组与黄芪多糖各剂量组比较其比值升高，见表1、图1—10。

表1　黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2、Bax表达的影响（s）个/HP

表1　黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2、Bax表达的影响（s）个/HP

注：与假手术组比较，*表示P＜0.05；与模型组比较，#表示P＜0.05。

组别平均阳性细胞数/个Bcl-2/Bax Bcl-2 Bax假手术组4.55±0.79 4.09±1.22 1.11模型组11.46±1.05*16.59±1.91*0.69阳性对照组17.63±1.20#11.78±0.91#1.50黄芪多糖高剂量组15.45±1.66#12.39±0.75#1.25黄芪多糖中剂量组15.83±1.72#15.50±0.55 1.02黄芪多糖低剂量组13.34±1.36 15.27±1.04 0.87

图1　假手术组Bcl-2蛋白×40

图2　模型组Bcl-2蛋白×40

图3　阳性对照组Bcl-2蛋白×40

图4　黄芪多糖高剂量组Bcl-2蛋白×40

图5　黄芪多糖中剂量组Bcl-2蛋白×40

图6　黄芪多糖低剂量组Bcl-2蛋白×40

图7　假手术组Bax蛋白×40

图8　模型组Bax蛋白×40

图9　阳性对照组Bax蛋白×40

图10　黄芪多糖高剂量组Bax蛋白×40

2.2黄芪多糖对大鼠脑组织NO含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中N O的水平升高（P＜0.05），与模型组比较，黄芪多糖高剂量组中N O含量降低（P＜0.05），见表2。

表2　黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织匀浆NO含量的影响（s）

表2　黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织匀浆NO含量的影响（s）

注：与假手术组比较，*表示P＜0.05；与模型组比较，#表示P＜0.05。

组别剂量/［mg·（kg·d）-1］NO含量/（μmol·gpro-1）假手术组等体积羧甲基纤维素钠2.59±0.33模型组等体积羧甲基纤维素钠4.67±0.54*阳性对照组5 3.24±0.49黄芪多糖高剂量组120 2.12±0.37#黄芪多糖中剂量组60 4.28±0.48黄芪多糖低剂量组30 4.11±0.45

3　讨论

B cl-2和B a x基因是一对研究较为明确的在功能上相互对立的凋亡调控基因，两者之间的比例决定细胞受到刺激后是否发生凋亡，如果Bcl-2占优势则细胞存活，Bax占优势则细胞发生凋亡［4-5］。本研究显示，假手术组Bcl-2和Bax仅有微弱的表达；与假手术组比较，模型组Bcl-2、Bax阳性表达增加；黄芪多糖可促进脑缺血损伤大鼠脑组织Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白的表达，上调Bcl-2/Bax蛋白的表达比率，来抑制细胞发生凋亡。

NO可影响凋亡基因的表达，在星形胶质细胞中下调bcl-2和上调bax，激活caspase诱导细胞凋亡，并降低细胞线粒体跨膜电位，导致神经元凋亡［6］。本研究表明模型组大鼠脑组织中NO的水平升高，与bcl-2和bax的表达趋势一致，而黄芪多糖高剂量组大鼠脑组织中NO含量降低，说明黄芪多糖可以降低大鼠脑组织中N O含量，促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，从而抑制细胞凋亡，可能为黄芪多糖减轻大鼠脑缺血再灌注神经凋亡的机制之一。

［1］马宏钟，薛荣亮.Bcl-2相关蛋白与细胞凋亡和脑缺血再灌注损伤［J］.国外医学：麻醉学与复苏分册，2001，22（6）:362-364.

［2］Dorota S，Jul ita CB，Matylda M，et al. Bc l-2 and Bax protein are increased in neocor tical but not in thalamic apoptosis fol lowing devascularizing lesion of the cerebral cor tex in the rat:an immunohis to chemical study［J］.Brain Research，2004，1006（1）:133-149.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Car lson S，et al. Reversible middle cerebral artery occ lusion without craniectomy in rats［J］. St roke，1989，20（1）:84-91.

［4］武亚辉，卫建平，李光来，等.乌司他丁对大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质Bcl-2 Fas Caspase-3表达的影响［J］.中国药物与临床，2012，12（2）：173-175.

［5］邓娟，周华东，张莉莉，等.Bcl-2对脑缺血再灌注后神经元DNA的自我保护作用［J］.中国临床康复，2002，6（15）:2216-2217.

［6］Fehsel K，Kroncke KD，Meyer KL，et al. Nitr ic oxide induces apoptosis inmouse thymocytes［J］.J Immunol，1995，155（6）: 2858-2862.

In fluence of Astragalus Polysaccharideson the Contents of Bcl-2，Bax Protein and NO in the Brain Tissueof the Rats with Cerebral Ischem ia Reperfusion

SU Yun1，LIU Yongqi1，YAN Chunlu1，XUE Na1，WU Zhiwei1，NIE Lei1，WANG Yan2
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730020，China；2 Gansu Provincial Maternity and Child-care Hospital

Objective:To explore the influence of astragalus polysaccharides on the contents of Bcl-2，Bax protein and NO in the brain tissue of the rats after cerebral ischemia reperfusion.Methods:Seventy-two SPF rats were random ized into sham operation group，themodelgroup，positive controlgroup，high，moderate and low doses groups of astragalus polysaccharides，the ratmodelwas prepared by reformedm iddle cerebral artery occlusion，the expressionsof Bax protein and Bcl-2 proteinwere detected with immunohistochemicalmethod after differentmedication groupsw ere adm inistered w ith the corresponding herbs respectively，the expressions of NO protein was detected by nitrate reductasemethod.Results:1）The contentsof Bcl-2 and Bax in themodel groups increased notably compared w ith sham operation group；compared w ith themodel group，the expressions of Bcl-2 increased in high andmoderate dosesgroups of astragalus polysaccharides（P＜0.05）；the contentsof Bax protein decreased signifi-cantly in high dosegroup ofastragaluspolysaccharides（P＜0.05）.Comparedwith sham operation group，the ratio of Bcl-2/Bax lowered notably in themodelgroup，it rosewhen positive controlgroup was comparedwith differentdosesgroupsof astragaluspolysaccharides.2）Comparedw ith sham operation group，the levelof NO raised remarkably in themodelgroup（P＜0.05），comparedw ith themodel group，the contentsof NO decreased evidently in the high dose group of astragalus polysaccharides（P＜0.05）.Conclusion:Astragalus polysaccharides could improve the expressions of Bcl-2 and Bax protein；it could reduce the degrees of cellular apoptosis by increasing the ratio of Bcl-2/Bax，and decreasing the contentsof NO.

cerebral ischem ia reperfusion；Bcl-2；Bax；NO；astragalus polysaccharides

R286

A

1004-6852（2016）03-0010-04

2015-01-05

甘肃省教育厅第二批科研项目（编号1006B-08）；甘肃中医药大学校内中青年基金（编号BH2010-076）。

苏韫（1977—），女，硕士学位，副教授。研究方向：中医药免疫学研究。