DDC对婴儿双歧杆菌SOD酶活性的影响①

罗　燕　葛　兰　陈红兵　杨平常　刘志刚　杨　波

(深圳大学过敏反应和免疫学研究所，深圳518060)



DDC对婴儿双歧杆菌SOD酶活性的影响①

罗燕②葛兰③陈红兵②杨平常刘志刚杨波④

(深圳大学过敏反应和免疫学研究所，深圳518060)

①本文为国家自然科学基金资助项目(81300292)、广东省对外科技合作项目(No.2013B051000088)、深圳市科技计划国际科技合作项目(No.GJHZ20130408174112021)和深圳市科技计划基础研究项目(No.JCYJ20140418095735538、JCYJ20140828163633991)。

②南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047。

③深圳科兴生物工程有限公司，深圳518060。

④深圳大学光电工程学院光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室，深圳518060。

目的：探讨二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)对婴儿双歧杆菌超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用。方法：采用厌氧活化扩增法培养婴儿双歧杆菌，根据绘制出的最适生长曲线，在平台生长期内加入不同浓度(200、1 000 μmol/L)的DDC作用一段时间(0、0.5、1、2、4、24 h)，然后离心收集细菌、进行超声破碎，测定细菌裂解液中SOD的活性。作为阳性对照，我们也检测了DDC对小鼠肠道裂解液中SOD活性的影响。结果：我们发现上述不同浓度的DDC作用于婴儿双歧杆菌一定时间后，对其SOD活性无显著影响。动物实验表明DDC作用于小鼠一定时间后，与对照组相比，其SOD活性显著降低(P<0.01)。结论：DDC影响小鼠体内SOD活性，但不影响婴儿双歧杆菌SOD的活性。推断婴儿双歧杆菌SOD抑制剂不是DDC，SOD抑制剂尚需进一步研究。

二乙基二硫代氨基甲酸酯；抑制剂；婴儿双歧杆菌；超氧化物歧化酶

双歧杆菌是由法国巴斯德研究所的Henry Tissier于1989年从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到的。它是发现最早的生理性细菌之一。目前，常见的双歧杆菌主要有5个菌种，包括：长双歧杆菌、短双歧杆菌、双叉婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。其中婴儿双歧杆菌是婴儿肠道内的一种优势菌种，具有抗氧化、抗肿瘤、维持肠道正常菌群平衡、提高免疫力等生理功能[1]。Sekine等[2]人研究了婴儿双歧杆菌细胞壁对小鼠腹腔巨噬细胞的激活作用，结果表明其可使IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA 表达增强。同时，该研究还证实婴儿双歧杆菌能显著抑制小鼠皮下移植的纤维肉瘤的生长[3]。国内也有一些相关的研究，发现了上述国外研究者报道的婴儿双歧杆菌的生物活性[4]。Talwalkar等[5]报道了双叉型双歧杆菌有抗氧化的能力，并发现其无细胞提取物具有超氧化物酶(Superoxide dis-mutase,SOD)活性。目前还未见关于婴儿双歧杆菌抗氧化活性的报道。SOD活性是婴儿双歧杆菌抗氧化功能的重要指标，为了进一步探讨其抗氧化活性的作用机制，目前亟需确定婴儿双歧杆菌SOD的有效抑制剂。因此，本文首次研究了婴儿双歧杆菌的生长规律，并选取最常见的SOD抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸酯(Diethyldithiocar-bamate,DDC)[6,7]加入到预先培养的婴儿双歧杆菌菌液中[8,9]，分析其SOD活性。

1　材料与方法

1.1材料SPF级BALB/c雌性小鼠，6～8周，体重18～23 g，购自广东省医学实验动物中心，婴儿双歧杆菌(SQC013-2)购自深圳科兴生物工程有限公司，DDC购自美国Sigma公司，SOD试剂盒购自南京建成生物工程公司，BCA蛋白浓度试剂检测盒购自北京索莱宝科技公司，益生菌TPY液体培养基购自青岛高科技园海博生物公司。

1.2方法

1.2.1婴儿双歧杆菌增菌培养取4支含有15 ml TPY液体培养基的试管，分别接种0.05、0.1、0.2 ml双歧杆菌冻干粉末到15 ml的TPY液体培养基中，充分混匀，封口膜密封，其中1支不接种，作为阴性对照。将4支试管置于37℃，150 r/min的恒温摇床中培养。

1.2.2菌液OD600的测定及最适生长曲线的绘制分别培养0、4、8、20、24 h取出0.5 ml菌液用酶标仪测定OD值，重复该实验3次，测得其平均吸光值。以婴儿双歧杆菌菌液培养时间为横坐标，所测菌液的平均OD600值为纵坐标，参考大肠杆菌的生长曲线图[10]绘制出婴儿双歧杆菌达到稳定期时(OD600约为1.0)的最适生长曲线图。

1.2.3DDC处理预先培养的婴儿双歧杆菌选取上述最适培养条件，培养分装得到12支含有婴儿双歧杆菌TPY菌液，分成两组。第一组在培养第0、20、22、23、23.5 h，每管分别加入200 μmol/L浓度的DDC。另外一组，用同样的方法将1 000 μmol/L浓度的DDC也加入到婴儿双歧杆菌中，每组有一支菌液不加DDC(0 h)作阴性对照[11-14]。

1.2.4DDC处理小鼠实验组小鼠随机分为2组，每组7只。参考Khadlga等方法[15]给小鼠皮下注射DDC[400 mg/(kg·d)，隔天一次，共7次]，2周后处死小鼠。提取其肠道组织物，测定SOD活性，另外一组小鼠注射相同剂量的生理盐水作为阴性对照。

1.2.5样本SOD活性测定婴儿双歧杆菌提取物按照戴佳锟等[16]的方法，进行细菌破壁并略作优化。每毫升菌液(1×108CFU/ ml)，1 400 r/min离心5 min，收集菌体。加入一定量的蛋白裂解液和酶抑制剂重悬菌体，置于冰上超声裂解。超声破碎条件为功率300 W、时间10 min、时间间隔(工作时间∶间歇时间)为10∶10(s/s)，菌液浑浊至透明表示裂解完全。采用液氮研磨法提取小鼠空肠蛋白。以上两种提取物均采用高速离心机(10 000 r/min ，4℃，20 min)离心沉淀取上清蛋白，BCA试剂盒检测其蛋白浓度，然后用试剂盒测定婴儿双歧杆菌无菌体内容物SOD酶活性，具体操作严格按照试剂盒说明书。

2　结果

由于细菌悬液的浓度与混浊度呈正比，因此测得的OD600值可以反映出菌液的浓度,OD值越大,说明生长的细菌越多。由表1可以看出，不同体积的冻干菌粉末在TPY培养基中随着培养时间的延长，OD600值先增大，后又逐渐平稳，相邻时间段内细菌数呈显著性增长(P<0.05)。说明婴儿双歧杆菌悬液中的细菌总数随着培养时间的延长经历了一个先增多后稳定的过程。通过了解细菌的生长规律，我们选取了有效体积的冻干菌粉末于TPY培养基中进行扩增培养，用于后续实验。

2.2婴儿双歧杆菌最适生长曲线绘制以0.1 ml婴儿双歧杆菌冻干粉菌液培养时间为横坐标，以各时间点所测得菌液的吸光值OD600为纵坐标，绘制出婴儿双歧杆菌(SQC013-2)的最适生长曲线，见图1。

表1　三种体积婴儿双歧杆菌在不同时间的OD600值间的差异性分析Tab.1　Different OD600 among three kinds of BB volume

表2　BCA试剂盒测定婴儿双歧杆菌蛋白浓度Tab.2　Protein concentrations of BB by BCA kit

图1　婴儿双歧杆菌的最适生长曲线图Fig.1　Growth curve of BB

图2　200 μmol/L浓度DDC对婴儿双歧杆菌SOD活性的作用Fig.2　Effect of DDC (200 μmol/L) on activity of SOD of BB

图3　1 000 μmol/L浓度DDC对婴儿双歧杆菌SOD活性的作用Fig.3　Effect of DDC (1 000 μmol/L) on activity of SOD of BB

图4　DDC对小鼠肠道SOD活性的作用Fig.4　Effect of DDC on activity of SOD of murine intestineNote: *.P<0.01,Compared with ctrl group.

2.3DDC对婴儿双歧杆菌SOD活性的作用按照以上条件培养24 h后(达到平台生长期)，加入不同浓度的DDC作用于婴儿双歧杆菌菌液，用标准细菌裂解法提取蛋白物，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，结果见表2。用SOD试剂盒检测婴儿双歧杆菌蛋白裂解物，分别测得200 μmol/L和1 000 μmol/L浓度的DDC作用双歧杆菌的抑制率，计算出单位内酶的活性，结果见图2和图3，与阴性对照组相比，各组间差异无显著性意义(P>0.05)。DDC作用小鼠后，采用上述同样方法测定肠道组织提取物的蛋白浓度和SOD酶活性(P<0.01)，见图4。结果发现，DDC可显著抑制小鼠肠道组织中SOD的活性。

3　讨论

一定数量的细菌，接种于合适的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，其生长过程具有先增长后平稳的规律。本研究将婴儿双歧杆菌接种于TPY液体培养基，于37℃培养，其生长也符合这一规律。

本次试验中，摸索三种体积的婴儿双歧杆菌，在密闭的15 ml含有TPY培养基的离心管中(最适合本实验的生长规律的菌样体积)。肠道益生菌需要保持很高的活菌数才能发挥其生理功能，因此本实验最终确定体积为0.1 ml的婴儿双歧杆菌，在平稳期OD600=1左右，对应的细菌数量为1×108CFU/ ml。在这个范围内婴儿双歧杆菌处于稳定期，细菌总数是整个生长阶段最多的，能够发挥较好的生物活性作用。此时，将DDC加入预处理的婴儿双歧杆菌菌液作用不同的时间，测定DDC对婴儿双歧杆菌SOD的抑制率，计算出婴儿双歧杆菌细胞内的SOD活性，结果显示DDC不影响婴儿双歧杆菌型SOD活性。而动物实验表明，DDC能抑制动物体内的SOD活性，与先前研究者报道一致[15]。说明DDC对婴儿双歧杆菌的SOD不起作用。

众所周知，SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，在微生物及动植物中均有发现，主要分为三类：铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)[17]和铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)[18]。近期国内外研究报道，DDC是常见真核类Cu/Zn-SOD抑制剂[19]，同时DDC也能够抑制大肠杆菌中的SOD活性[20]。设想DDC可能也和以往研究者发现的一样能够抑制婴儿双歧杆菌体SOD活性，但实验并没有出现我们预期设想的结果。提示婴儿双歧杆菌中的SOD可能不属于Cu/Zn-SOD，其抑制剂的类型还需要进一步探讨，以便完善婴儿双歧杆菌抗氧化活性功能的机制研究。

婴儿双歧杆菌作为婴儿肠道内最重要的优势生理菌群,降低过敏性疾病的发生，能够黏附肠道抑制致病菌，从而减少内毒素、胺类等毒性物质的产生，防止其对肠道的毒害，起到保护肠道的作用，增强机体的免疫功能。在食品工业界内可用作日常饮料和食品的添加剂,用于机体胃肠道功能紊乱等疾病的防治,因而有着巨大的潜在应用价值。研究婴儿双歧杆菌抗氧化活性是探讨其生物活性机制的重要指标之一，故研究其SOD抑制剂的类型对抗氧化机制的研究具有重要意义。

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[收稿2015-10-21修回2016-05-16]

(编辑倪鹏)

Effect of DDC on activity of SOD of Bifidobacteria infantis

LUO Yan，GE Lan，CHEN Hong-Bing，YANG Ping-Chang，LIU Zhi-Gang，YANG Bo.Institute of Allergy and Immunology,School of Medicine,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China

Objective:To investigate whether diethyldithiocarbamate (DDC) affect the activity of superoxide dismutase (SOD) of Bifidobacterium infantis (BB).Methods: We used simple anaerobic activated ways to culture BB.After the bacterium reached platform growth period,two concentrations (200 and 1 000 μmol/L) of DDC were added to bacterium medium for a specific period of time (0.5,1,2,4 and 24 h),which was in order to determine if this inhibitor affected the activity of SOD.As a positive control,the inhibitory effect of DDC on the activity of SOD in murine intestinal samples was also checked.Results: It was found that incubation of BB with DDC for some specific periods showed no effect on the activity of SOD.However,the activity of SOD in intestine reduced dramatically after the mice were given DDC in vivo.Conclusion: DDC affect the SOD activity in mice,while it showed no effect on SOD activity of BB.The suitable inhibitor for SOD of BB is not commercially available and further research is warranted.

Diethyl dithiocarbamate;Inhibitor;Bifidobacterium infantis;Superoxide dismutase

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.004

R3文献标志码A

1000-484X(2016)08-1103-04

罗燕(1989年-)，女，硕士，主要从事预防免疫学方面研究，E-mail:18566660351@163.com。

及指导教师：杨波(1983年-)，女，博士，主要从事过敏性疾病研究，E-mail:ybbio@163.com。