Ⅰ，Ⅱ期宫颈癌组织HIF-1α与COX-2蛋白共表达对预后的影响及机制*

罗爱华，丰大利，付娟，李欣

（三峡大学第二人民医院暨宜昌市第二人民医院 肿瘤放化疗科，湖北 三峡 443000）



Ⅰ，Ⅱ期宫颈癌组织HIF-1α与COX-2蛋白共表达对预后的影响及机制*

罗爱华，丰大利，付娟，李欣

（三峡大学第二人民医院暨宜昌市第二人民医院 肿瘤放化疗科，湖北 三峡 443000）

目的探讨Ⅰ，Ⅱ期宫颈癌组织中HIF-1α与COX-2蛋白的共表达对预后的影响及可能的机制。方法免疫组织化学法分析71例宫颈癌标本的HIF-1α和COX-2的共表达情况；RT-PCR法检测标本中HIF-1α mRNA和COX-2 mRNA的表达水平。χ2检验分析不同表达组患者1、2和3年存活率的差异；采用KM生存分析法了解不同表达组患者的存活时间的差异；采用相关分析了解蛋白及mRNA表达水平的相关性。结果HIF-1α和COX-2共表达组患者的3年存活率低于非共表达组（P＜0.05）；HIF-1α和COX-2共表达组患者的存活时间低于非共表达组（P＜0.05）；在Ⅱ期患者中，HIF-1α的蛋白水平与COX-2 mRNA的水平正相关（rs=0.594，P＜0.05）。结论在Ⅰ，Ⅱ期宫颈癌中，HIF-1α和COX-2共表达组预后较差；HIF-1α蛋白可能正向调控COX-2 mRNA的表达。

宫颈癌；缺氧诱导因子1α；环氧合酶2；共表达；生存分析

缺氧是实体肿瘤形成的重要因素之一，在肿瘤形成时会造成正常血管压迫或阻塞导致缺氧环境加重，但在缺氧微环境下恶性肿瘤仍可不断生长、浸润甚至发生转移，说明肿瘤细胞对缺氧具有很强的适应能力。缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是1992年SEMENZA与WANG在低氧的肝癌细胞株Hep3 B细胞的核提取物中发现的一种蛋白质，由两个亚基组成的异二聚体：HIF-1α和HIF-1β，都具有二聚化所需的碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）和PAS（PERARNT-SIM）结构域［1］。缺氧诱导因子1α（HIF-1α）既是HIF-1活性的调节亚基又是活性亚基，是目前发现的唯一的一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。已在多种恶性肿瘤及癌前病变中检测到HIF-1α蛋白的过度表达，但正常组织及良性病变中则无表达。环氧合酶（Cyclooxygenase，COX，）是分解花生四烯酸（arachidonic acid，AA），生成各种内源性前列腺素（Prostaglandins，PGs）过程中重要的限速酶。目前，人们认为COX至少有3种形式：COX-1，COX-2，COX-3［2］。COX-2属于反应基因，在静止细胞中不易被检测到。COX-2呈诱导性表达，在大多数正常组织中表达极少，而当细胞接受各种刺激如细胞因子、生长因子、癌基因及促肿瘤剂的诱导后表达上调，参与炎症及肿瘤的发生［3-5］。包括结肠癌［6］，肝癌［7-8］，胰腺癌［9］在内的多种肿瘤组织均发现有COX-2的高表达，并与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。本实验采用免疫组织化学及RT-PCR方法检测HIF-1α和COX-2的蛋白和mRNA表达水平。按蛋白表达情况分组，探讨HIF-1α和COX-2共表达及非共表达组的生存率及生存时间的差异。探讨HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA水平的相关性，或COX-2蛋白水平和HIF-1αmRNA水平的相关性，明确HIF-1α和COX-2可能存在的调节关系。

1　资料与方法

1.1临床资料

选取2003年9月～2012年2月确诊并行手术治疗的71例宫颈癌标本。所有病例临床资料完整，患者年龄23～77岁，平均年龄46.3岁。所有患者术前均未行放化疗，术后病理类型均为鳞癌，分期为Ⅰb～Ⅱb期。术后行放疗或放化疗。

1.2HIF-1α和COX-2免疫组织化学检测

1.2.1实验方法及步骤固定后洗涤、脱水、透明浸蜡包埋，5μm切片，60度30 min脱蜡2次。水化后抗原修复、阻断、封闭。然后加一抗，HIF-1α多克隆抗体浓度为1∶400、COX-2多克隆抗体浓度为1∶150，上述一抗均购自Abcam公司。4℃过夜，再加HRP标记二抗40 min；DAB染色3～10 min，苏木精复染，显微镜下观察。

1.2.2免疫组织化学结果判定采用病理图像系统分析每张切片随机取3个高倍视野（10×20），HIF-1α按细胞核或细胞浆呈棕黄色染色为阳性；COX-2以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。免疫组织化学染色指数为染色面积与染色强度的乘积。

1.3RT-PCR检测宫颈癌组织HIF-1αmRNA与COX-2 mRNA的表达情况

Trizol试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度（A260/250＞1.8）。取总RNA 5μg，按逆转录反应试剂说明完成cDNA的合成。PCR扩增条件：95℃预变性10 min，95℃、15 s、60℃、45 s循环40次。取2μl PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。数据采用仪器自带软件分析，ABI Prism 7500 SDS Software。见表1。

表1　扩增引物序列表

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计数资料用χ2检验，计量资料采用相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier统计学分析及COX回归分析。

2　结果

2.1免疫组织化学结果

HIF-1α阳性表达的宫颈癌标本细胞成团分布，细胞质浓染，呈棕黄色染色，见图1。71例宫颈癌组织中41例HIF-1α阳性，阳性率57.8%。COX-2阳性表达的宫颈癌标本细胞成团分布，细胞质浓染，呈棕黄色染色，见图2。71例宫颈癌组织中53例COX-2阳性，阳性率74.6%。71例宫颈癌组织中HIF-1α与COX-2共表达33例，共表达率46.5%。

2.2HIF-1α和COX-2共表达对生存率的影响

根据HIF-1α和COX-2的表达情况分为4组：1组，HIF-1α 阴性，COX-2阴性组；2组，HIF-1α阴性，COX-2阳性组；3组，HIF-1α阳性，COX-2阴性组；4组，HIF-1α阳性，COX-2阳性组。各组的存活率见表2，经χ2检验各组3年存活率有显著性差异，P＜0.05。经行×列χ2分割分析，HIF-1α和COX-2共表达组即4组的3年存活率显著低于另外3组，Pearsonχ2=7.289，P=0.007；而非共表达的3组间3年存活率差异无统计学意义。

2.3生存时间的影响因素

根据HIF-1α和COX-2的表达情况分为4组：1组，HIF-1α阴性，COX-2阴性组；2组，HIF-1α阴性，COX-2阳性组；3组，HIF-1α阳性，COX-2阴性组；4组，HIF-1α阳性，COX-2阳性组。以上4组K-M生存曲线见图3，Breslowχ2=9.845，P=0.02，提示按免疫组织化学不同分组的生存分布差异有统计学意义。按患者年龄分组，以45岁为划分标准，按年龄＜45岁组与龄≥45岁组对生存生存时间的影响，做Kaplan-Meier统计学分析，Breslowχ2=0.027，P=0.870，提示不同年龄分组的生存分布差异无统计学意义。按患者临床分期进行Kaplan-Meier统计学分析，了解临床分期对患者生存时间的影响，Breslow χ2=8.482，P=0.014，提示不同临床分期的生存分布差异有统计学意义。采用COX回归模型分析影响患者生存分布的危险因素。多因素回归分析提示患者临床分期及HIF-1α和COX-2免疫组织化学表达情况分别是独立的预后因素，见表3。

2.4HIF-1α和COX-2 mRNA的表达情况

HIF-1αmRNA和COX-2 mRNA的扩增动力曲线见图4。COX-2 mRNA在宫颈癌组织中的表达水平与分期有关，Ⅱ期宫颈癌组织的表达水平显著高于Ⅰ期宫颈癌患者。

2.5HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA表达的相关性

免疫组织化学指数反映蛋白的表达水平，mRNA含量反应了mRNA的表达水平。在Ⅱ期宫颈癌中，HIF-1α蛋白水平和COX-2 mRNA的表达水平呈显著正相关，r=0.594，P＜0.05。而在Ⅰ期宫颈癌组织中两者相关性不明显。可能与Ⅱ期宫颈癌组织乏氧状况更明显有关。

图1　HIF-1α阳性表达情况 （SP×200）

图2　COX-2阳性表达情况 （SP×200）

表2　各组存活率的比较

表3　COX模型筛选的危险因素及参数估计

图3　不同免疫组织化学分组的Kapplan-meire生存曲线

图4　mRNA扩增动力曲线

3　讨论

恶性实体肿瘤由于增长迅速，经常会常出现缺氧的微环境，缺氧是恶性肿瘤治疗效果差，容易出现放化疗耐受性的常见原因之一。CHOI等［10］认为在肿瘤发生早期即可发生HIF-1的过度表达，并且HIF-1的过度表达与肿瘤血管形成、侵袭转移能力有关。正常氧分压下，细胞内HIF-1α不稳定，经泛素一蛋白酶体等途径迅速降解。缺氧时，胞质中HIF-1α稳定性增加，降解受阻，积聚增多并转移到核内，与核内的HIF-β结合成二聚体，形成有活性的HIF-1，继而与缺氧反应基因结合，激活转录过程，引起一系列的细胞对缺氧的反应［11］。迄今为止，确定的受HIF-1调控的缺氧反应基因有70多种［12］。该产物涉及参与肿瘤细胞的能量代谢、增殖、凋亡、转移、耐药及血管扩张、血管新生等多个方面。COX-2属于反应基因，在静止细胞中不易被检测到。COX-2在上皮组织癌（包括胃癌、直结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等）中普遍存在过度表达现象，并影响患者的预后［13］。COX-2介导的生物学效应涉及肿瘤血管新生、细胞的增殖和凋亡、促进肿瘤细胞迁移，细胞黏附和肿瘤侵袭等。有资料显示HIF-1α，COX-2表达情况与患者预后有关。本实验资料显示，HIF-1α和COX-2共表达组的1年，2年，3年存活率均低于非共表达组；HIF-1 α和COX-2共表达组的存活时间显著低于非共表达组，并且HIF-1α和COX-2共表达可以作为一个独立的预后因素。两者共表达预后较差，可能与两者共同促进肿瘤的恶性行为有关。

对于HIF-1α和COX-2的关系，STASINOPOULOS等［14］认为COX-2可通过其催化产物PGE2激活HIF-1α活性以促进肿瘤血管生成。TAMMALI等［15］提出COX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF途径可能是COX-2促进肿瘤血管生成的又一条途径。LIM等［16］通过研究发现，COX-2选择性抑制剂NS398通过COX-2/PGE2途径抑制HIF-1αmRNA的表达，减少HIF-1α的合成，从而抑制缺氧诱导的血管生成。JUNG等［17］的研究显示，HIF-1是关联炎症和癌变过程的一个重要转录因子，IL-1诱导活化NFKB/COX-2途径，上调HIF-1α蛋白的表达，并最终上调VEGF的表达，促进肿瘤血管生成。STASINOPOULOS等［14］发现PGE-2可以增强丝裂原活化激酶（MAPK）的活性，从而加速HIF-1α翻译转录和在核内的积聚。上述研究均表明，COX-2可调控HIF-1α蛋白的表达。但也有学者持不同意见，认为COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一，受缺氧的诱导活化［18］。CSIKI等［19］的最新的研究通过对缺氧反应基因序列的比较，COX-2启动子缺失分析和定向诱变，证实在COX-2启动子内存在缺氧反应元件（hypoxia-responsive element，HRE），通过其与HIF-1α的结合，激活肺癌细胞中COX-2的表达。本组资料显示，HIF-1α和COX-2 mRNA的表达呈正相关（rs=0.594，P＜0.05），因此可以推断，COX-2 mRNA的表达受HIF-1α水平的调控。HIF-1α可能通过与COX-2启动子内存在缺氧反应元件（HRE）结合，促进COX-2的转录。从而认为COX-2是HIF-1α下游的靶基因之一。HIF-1α蛋白可能正向调控COX-2 mRNA的表达。

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（张蕾编辑）

Influence of the coexpression of HIF-1α and COX-2 on prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠand stageⅡand possible functional mechanism*

Ai-hua Luo，Da-li Feng，Juan Fu，Xin Li
（Department of Chemo-irradiation Oncology，Yichang Second People's Hospital，Yichang，Hubei 443000，China）

Objective To investigate the influence of the coexpression ofHIF-1αandCOX-2on the prognosis of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ and the possible functional mechanism.Methods The coexpressions ofHIF-1αandCOX-2were detected in 71 cases with cervical cancer by immunohistochemical.The levels ofHIF-1αmRNA andCOX-2mRNA were detected by RT-PCR.Chi-squared test was used to analyze the differences of survival rate from one year to three year in different groups；KM survival analysis was used for the survival time in different groups；correlation analysis was used to analyze the correlation between protein and mRNA level.Results The survival rate of three year in the group of coexpression ofHIF-1αandCOX-2was significantly lower than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.The survival time in the group of coexpression ofHIF-1α andCOX-2was significantly shorter than that in the non-coexpression group（P＜0.05）.There was a positive correlation between theHIF-1αprotein level and theCOX-2mRNA level in the patients with cervical cancer in stageⅡ（rs=0.594，P＜0.05）.Conclusions The prognosis is poorer in the group of coexpression ofHIF-1αand COX-2of patients with cervical cancer in stageⅠ and stageⅡ than the non-coexpression group.TheHIF-1αprotein may upregulate the level ofCOX-2mRNA.

cervical cancer；HIF-1α；COX-2；coexpression；survival analysis

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.014

1005-8982（2016）16-0067-05

2016-04-14

宜昌市医疗卫生科研项目（No：A14301-31）［通信作者］李欣，E-mail：lixinyc5189@163.com