S100A11-RAGE通过P38MAPK信号转导通路调控小鼠骨关节炎软骨细胞肥大和细胞外基质代谢

赵晓，黄飞麒，姚乃婕，陈扬声

（广东药科大学附属第一医院 正骨科，广东 广州 510080）



S100A11-RAGE通过P38MAPK信号转导通路调控小鼠骨关节炎软骨细胞肥大和细胞外基质代谢

赵晓，黄飞麒，姚乃婕，陈扬声

（广东药科大学附属第一医院 正骨科，广东 广州 510080）

目的探讨S100A11-RAGE通过P38MAPK信号转导通路对小鼠骨关节炎软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控。方法不同浓度的外源性S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）与小鼠软骨细胞孵育48 h，检测基质金属蛋白酶13（MMP-13）、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达，以筛选作用最显著的S100A11浓度。加入不同浓度Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）与小鼠软骨细胞预孵育12 h后，再加入作用最强的外源性S100A11孵育（10μg/ml）48 h，检测MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达。结果小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达随外源性S100A11浓度的增加而增加，且明显高于对照组；而Ⅱ型胶原蛋白表达随外源性S100A11浓度的增加而减少，且明显低于对照组。加入Anti-P38预处理后，MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达均明显低于S100A11单独处理组，而Ⅱ型胶原蛋白表达明显高于S100A11单独处理组。结论外源性S100A11通过与RAGE结合，并经P38MARK信号转导通路诱导软骨细胞肥大和细胞外基质的降解，其机制可能与通过P38MAPK信号转导通路诱导MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达，并降低Ⅱ型胶原蛋白表达。

S100A11-RAGE；P38MAPK信号转导通路；软骨细胞肥大；细胞外基质代谢

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种慢性进行性骨关节疾病，其发病率随年龄的增长而显著增加，流行病学研究显示，55岁以上中老年人OA发病率为44%～70%，而65岁以上人群中男性发病率为60%，而女性达70%［1］。OA的病因机制较为复杂，受年龄、遗传、创伤及代谢等多种因素的影响，而年龄是引起OA发病和进展的最重要的危险因素之一［2］。随着我国人口老龄化的加剧，OA的发病呈日益增高的趋势，所以对于OA的防治具有十分重要的意义。有研究认为，OA是由于多种炎症介质和基质成分等生物性因素，通过与其受体特异性地结合将信号传递进细胞核，启动炎症基因和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的转录表达，最终导致关节软骨细胞肥大和细胞外基质代谢失调［3］。

已有研究证实，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）及其受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）能通过直接或经由不同的细胞内信号转导通路参与包括类风湿性关节炎、糖尿病肾病、骨质疏松、阿尔茨海默病以及冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种疾病的发生、发展［4］。但RAGE在OA的发生、发展中起到何种作用，尚不十分清楚，有研究认为这可能与AGEs/RAGE触发活化促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）信号转导通路有关［5］。P38信号转导途径是MAPK途径的一种，研究显示，P38MAPK信号转导通路与软骨细胞表型维持和细胞分化，软骨细胞的肥大、钙化和凋亡，软骨细胞基质金属蛋白酶的合成以及炎症因子的产生等密切相关。S100蛋白被认为是一组钙离子传感器，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分化、黏附、运动、基因表达及凋亡过程中发挥重要作用。其家族成员S100A4、S100A6和S100A13等已被证实可促进骨肉瘤的侵袭、转移［6-8］。S100蛋白的另一家族成员S100A11则参与多种细胞内的活性调节［9］，在胃癌、结肠癌和乳腺癌等肿瘤的发生、发展中的作用已有较多研究［9-11］。研究显示，当软骨细胞受到白细胞介素1等促炎症因子刺激时S100A11会释放到软骨细胞外与RAGE结合，从而促进软骨细胞肥大。本研究旨在通过外源性S100A11及P38MAPK信号转导通路相关抑制剂，作用于小鼠软骨细胞后对MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响，以探明S100A11-RAGE和P38MAPK信号转导通路对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控，旨在揭示OA的发病机制，为研发有效的防治药物开辟新的思路，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

RMIP 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美国），Ⅱ型胶原蛋白酶（Gibico公司，美国），S100A11、anti-RAGE、anti-P38（Santa Cruz公司，美国），MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白单克隆抗体、非免疫性山羊血清、荧光二抗（Santa Cruz公司，美国），TRIzol（Invitro-gen公司，美国），PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本），逆转录试剂盒（ABI Applied Biosystems公司，美国）。

1.2实验方法

1.2.1小鼠软骨细胞的培养无菌条件下，麻醉后取小鼠髋关节和膝关节处软骨，剪成1 mm3小块，转移至培养瓶内，加入0.25%的胰蛋白酶，5%二氧化碳CO2、37℃培养箱中孵育1h，弃去胰蛋白酶，加入0.2%的Ⅱ型胶原蛋白酶，继续孵育消化。2 h后，收集消化液，1 000 r/min离心5 min，所得细胞接种于含10% FBS的RMIP 1640P培养基，5%二氧化碳CO2、37℃培养箱中培养。实验用细胞为1～3代。

1.2.2实验分组与干预在小鼠软骨细胞中加入不同浓度的外源性 S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育48h后，检测MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达，以筛选作用最显著的S100A11浓度。

在小鼠软骨细胞中加入Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育12 h后，再加入前面筛选出的作用最显著的SA00A11浓度（10μg/ml）。孵育48 h后，检测MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达，以观察阻断P38MAPK信号转导通路后，对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的影响。

1.2.3PCR检测MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表达提取总细胞总RNA，逆转录成cDNA。参照文献［4］，设计MMP-13、ADAMTS-5以及G3PDH的引物，由上海吉玛制药技术有限公司合成。MMP-13正向引物：5'-CTTGATGCCATTACCAGTC-3'，反向引物：5'-GGTTGGGAAGTTCTGGCCA-3'。ADAMTS-5正向引物：5'-TATGACAAGTGCGGAGTATG-3'，反向引物：5'-TTCAGGGCTAAATAGGCAGT-3'。GAPDH正向引物：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3'。PCR扩增参数：94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s、共32个循环，最后72℃延伸7 min。

1.2.4蛋白免疫印迹法（Western b l ot） 检测MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达收集各组细胞，PBS淋洗后加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解30 min，刮离细胞转移至离心管，20 000 r/min离心30 min，取上清液置入-20℃冰箱冷冻保存备用。分别以50μg等量总蛋白上样，经8%SDS-PAGE电泳分离，转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，TBST淋洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗，4℃孵育过夜；TBST淋洗，加入辣根过氧化物酶标记的荧光二抗，37℃孵育1 h；TBST淋洗，DAB显色。

1.2.5免疫细胞化学检测Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达取对数生长的小鼠软骨细胞按1×105的密度接种于6孔板中，将2%多聚赖氨酸包被处理的玻片置于孔中以进行细胞爬片；培养24 h后，待细胞紧贴玻片，取出玻片，PBS淋洗，95%酒精固定；PBS淋洗，加过氧化酶阻断剂，37℃孵育30 min；PBS淋洗，加非免疫性山羊血清，37℃封闭30 min；PBS淋洗，加一抗，4℃孵育过夜；PBS淋洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS淋洗，DAB染色，苏木精复染，95%酒精脱水，透明，封片，每张切片任选5个视野，采用Image Pro plus 6.0软件进行半定量分析，测量每张切片阳性染色灰度值［5］。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同浓度S100A11对MMP-13和ADAMTS-5表达的影响

不同浓度外源性S100A11孵育48 h后，小鼠软骨细胞MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及其蛋白的表达较对照组显著上调（P=0.031，0.022和0.009），且其表达呈浓度依赖性增加，以S100A11为10μg/L时表达最强。见图1。

2.2不同浓度S100A11对Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响

Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色灰度值随S100A11浓度增大而增大，且明显低于对照组（P= 0.000）（见图2A）；Ⅹ型胶原蛋白灰度值随S100A11浓度增大而减小，且明显高于对照组（P=0.026）（见图2B）。提示随S100A11浓度增大，Ⅱ型胶原蛋白表达逐渐减少，明显低于对照组（P=0.007）；而Ⅹ型胶原蛋白表达逐渐增加，明显高于对照组（P=0.018）。

图1　PCR和Western blot检测不同浓度S100A11处理后小鼠软骨细胞MMP-13和ADAMTS-5的表达，条带图下面对应的是条带灰度值的柱状图

图2　免疫组织化学检测分析不同浓度S100A11处理对小鼠软骨细胞Ⅱ和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响，右图为对应灰度值的柱状图

2.3Anti-P38对MMP-13和ADAMTS-5表达的影响

不同浓度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，检测MMP-13和ADAMTS-5的表达。结果显示，MMP-13和ADAMTS-5的mRNA及蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而减少，且明显低于S100A11单独处理组（P=0.004）。见图3。

2.4Anti-P38对Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响

不同浓度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，检测Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达。结果显示，Ⅱ型胶原蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而减少，且明显低于S100A11单独处理组（P=0.001）；Ⅹ型胶原蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而增加，且明显高于S100A11单独处理组（P=0.002）。见图4。

图3　Anti-P38对MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及相应蛋白表达的影响

图4　Anti-p38对Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响

3　讨论

OA的病理生理过程主要表现为关节软骨细胞的分解代谢明显大于合成代谢，导致软骨基质进行性丢失。OA发病时，各种基质金属蛋白酶的表达和含量明显增高，加剧细胞软骨基质的分解，其中基质金属蛋白酶MMP-13对于Ⅱ型胶原蛋白具有强烈的裂解作用，在OA的发生、发展中起着十分重要的作用［12］。ADAMTS-5是细胞软骨基质蛋白聚集蛋白聚糖Aggrccan的降解酶，研究发现，OA患者骨关节中存在Aggrccan被大量降解破坏的现象［13］。Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖Aggrccan是软骨基质中的主要成分，Ⅱ型胶原蛋白是构成纤维网架结构的主体，具有很强的抗张性，而聚集蛋白聚糖Aggrccan对于关节的抗压力和分散负荷等具有重要作用，两者的表达和凋亡情况是反应软骨退变程度的最好指标［14］。当软骨细胞分化到增生末期时，Ⅹ型胶原蛋白的合成达到顶峰，提示Ⅹ型胶原与软骨骨化相关；而在OA中，观察到软骨基质退化后期Ⅹ型胶原蛋白表达的增加［15］。所以本研究选择MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白作为反映OA病变的主要检测指标。

年龄是引起OA发病和进展的最重要的危险因素之一。有研究认为，随着年龄的增加体内大量AGEs的产生和堆积是导致和加速年龄相关性OA病变的主要原因之一［16］。其机制可能与AGEs与RAGE特异性结合并激活细胞内一系列信号转导通路相关。

RAGE配体除了AGEs外还包括β淀粉样蛋白、高迁移率族蛋白1等等，而S100A11也是RAGE的配体。为探明S100A11-RAGE和P38MAPK信号转导通路对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控，本研究首先采用不同浓度的外源性S100A11作用于体外培养的小鼠软骨细胞，结果发现随着S100A11浓度的增加，小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅹ型胶原蛋白的表达较对照组显著上调，而Ⅱ型胶原蛋白的表达却逐渐减少。研究证实，外源性S100A11能通过与RAGE结合调控小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢。进一步的研究发现，小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅱ型胶原蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而显著减少，而Ⅹ型胶原蛋白的表达却随Anti-P38浓度的增加而增加。提示P38 MARK抑制剂Anti-P38可以显著抑制由外源性S100A11诱导的软骨细胞肥大和基质代谢增加。

综上所述，本研究通过体外培养小鼠软骨细胞，初步论证外源性S100A11通过与RAGE结合，并经P38MARK信号转导通路诱导软骨细胞肥大和细胞外基质的降解，从而导致软骨细胞功能障碍，研究旨在揭示OA的发病机制，为研发有效的防治药物开辟新的思路。

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（张蕾编辑）

Regulation ofS100A11-RAGEon hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byp38MAPK signal pathway in mice

Xiao Zhao，Fei-qi Huang，Nai-jie Yao，Yang-sheng Chen
（Department of Bone Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong 510080，China）

Objective To investigate the regulation ofS100A11-RAGEon the hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byP38MAPKsignal pathway in mice.Methods Different concentrations of exogenousS100A11and cartilage cells were incubated for 48 h.Expressions ofMMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected by PCR，Western Blot and immunohistochemistry，respectively.Anti-P38 and cartilage cells were incubated for 12 h，and then incubated 48 h after exogenous S100A11 was added.Expressions of MMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected.Results The expression ofMMP-13，ADAMTS-5 and type X collagen of cartilage cells increased with the increase of the concentration of exogenous S100A11，and was significantly higher than that of the control group.The expression of typeⅡ collagen decreased with the increase of the concentration of exogenousS100A11，and was significantly lower than that of the control group.After the addition of Anti-P38，the expressions ofMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen were significantly lower than that of S100A11 alone treatment group，and the expression of typeⅡcollagen was significantly higher than that of S100A11alone treatment group.ConclusionsS100A11-RAGEcan regulate the hypertrophy and extracellular matrixdegradation of chondrocytes in mice，and the mechanism may be related to the inducedMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen expression and reduce typeⅡcollagen expression through the P38 MAPK signal pathway.

S100A11-RAGE；P38MAPK signaling pathway；chondrocyte hypertrophy；extracellular matrix metabolism

R684

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.002

1005-8982（2016）16-0006-06

2016-01-11