2型糖尿病大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道α、β1亚基蛋白及mRNA表达水平变化*

段洪霞，葛李，崔传宝，吴知桂，陈美娟

（四川医科大学 药学院，四川 泸州 646000）



·论著·

2型糖尿病大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道α、β1亚基蛋白及mRNA表达水平变化*

段洪霞，葛李，崔传宝，吴知桂，陈美娟

（四川医科大学 药学院，四川 泸州 646000）

目的探讨2型糖尿病（T2DM）大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）α、β1亚基蛋白及mRNA表达水平变化，从分子水平阐明T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞膜BKCa通道活性改变的具体机制，为T2DM的综合治疗提供新靶点；为特异性针对此环节的药物研发提供实验依据。方法SD大鼠高糖高脂饮食1个月后腹腔注射链脲菌素STZ（25 mg/kg）建立T2DM大鼠模型。免疫印记法和实时定量聚合酶链式反应测定肠系膜动脉BKCa通道α和β1亚基的蛋白和mRNA表达水平。结果①免疫印迹结果显示：模型组在第8周和第12周肠系膜动脉大电导钙激活钾通道（BKCa）α蛋白相对表达量分别为（1.093±0.251）和（0.921±0.153），与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；β1蛋白相对表达量分别为（0.334±0.200）和（0.193±0.310），与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。②实时定量聚合酶链式反应结果显示，模型组在第8周和第12周肠系膜动脉BKCa α亚基mRNA的表达分别为（1.15±0.03）和（0.92± 0.04），与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；β1亚基mRNA的表达分别为（0.47±0.10）和（0.37± 0.12），与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论T2DM大鼠肠系膜动脉BKCa β1亚基蛋白和mRNA表达在8周及12周明显降低。

2型糖尿病；大电导钙激活钾通道；肠系膜动脉；α、β1亚基

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的血管并发症是本病致残致死的主要原因，作为血管张力的最终执行者及各种生化因子的最终作用靶点的血管平滑肌在众多的生化机制（氧化应激、慢性炎症、糖基化终产物损害、醛糖还原酶等）作用下，是否发生变化还尚未可知，血管平滑肌上的大电导钙激活 钾 通 道 （large-conductancecalcium-activated potassium channels，BKCa）是血管张力调节的关键负反馈器，叶春玲等［1］发现，1型糖尿病小鼠胸主动脉BKCa关闭时间缩短；李尚俭等［2］报道，胰岛素抵抗大鼠胸主动脉血管平滑肌BKCaβ1亚单位蛋白和mRNA表达降低。但有关T2DM大鼠肠系膜血管平滑肌BKCa是否存在异常的研究尚鲜有报道，本课题组前期研究［3］发现，T2DM大鼠血管反应性存在变化，并与血管平滑肌上BKCa可能存在相关性，本研究采用免疫印迹法（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术探讨T2DM大鼠不同病程阻力血管（肠系膜动脉）平滑肌上BKCaα、β1亚基蛋白及mRNA表达是否存在异常，以期为T2DM的综合治疗提供新靶点，为特异性针对此环节的药物研发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象成年SD大鼠，雄性，体重180～200 g，购自成都达硕动物有限公司；实验动物使用许可证号：SCXKC川22008-23。

1.1.2主要实验试剂链脲佐菌素（Streptozotoxin，STZ），总RNA提取试剂TRIzol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒Reverse Transcription System（成都博瑞克生物公司），小鼠抗人Actin单抗（美国Santa Cruz公司），兔抗人KCNMA1（BKCAα）多抗，批号：Lot#A1455，兔抗人KCNMB1（β1）（英国Abcam公司），荧光定量PCR试剂（日本Takara公司），批号：Lot No.1131801，膜蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物研究所），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物研究所），Taq酶PCR试剂（北京TIANGEN生物公司），批号：K9104琼脂糖（美国进口分装公司），RIPA裂解液（上海碧云天生物研究所），蛋白预染Marker（美国Fermentas公司），增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）发光液（美国millipore公司）批号：Lot No.1131801。

1.1.3主要实验仪器BIORAD电泳仪、电转仪（美国BIORAD生物公司），ABI实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），血糖监测仪，ND-100核酸蛋白检测仪（美国Nanodrop公司）。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立［4］将大鼠随机分成对照组10只、模型组40只，模型组大鼠喂养高糖高脂饲料（10%猪油、2.5%胆固醇、20%蔗糖、1%胆酸盐和66.5%的普通饲料）4周，腹腔注射STZ（25 mg/kg）1次，1周后以空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.0 mmol/L且伴有胰岛素敏感性降低者（P＜0.05）为成模指标，筛选出成模鼠20只继续高脂高糖饲养至12周，对照组大鼠普通饲料喂养12周，腹腔注射同体积柠檬酸缓冲液。

1.2.2标本的采集于8周、12周对照组、模型组大鼠分批腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，开腹取肠系膜动脉，分离血管周围的结缔组织及脂肪，然后放入RNA保存液，-80℃冰箱保存。

1.2.3免疫印迹法测定α和β1亚基蛋白表达量取大鼠肠系膜动脉，RIPA法冰上匀浆、消化，12 000 r/min离心1 min，收集上清液，BCA法蛋白定量。等量的蛋白（15 L）经SDSPAGE电泳分离后，电转印到硝酸纤维素膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的三乙醇胺缓冲盐水溶液室温封闭1 h。然后分别用兔抗大鼠Kca1.1抗体、兔抗大鼠 sol-1抗体、兔抗大鼠β-actin抗体4℃孵育过夜。过氧化物酶标记抗兔二抗，室温孵育1 h。ECL试剂盒化学荧光显像。以β-actin为内参，计算蛋白的相对表达量。

1.2.4实时定量PCR测定α和β1亚单位mRNA的表达取出冷冻保存于-80℃冰箱中大鼠肠系膜动脉，Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，然后用SYB Rgreen法进行PCR反应，GAPDH为内参照。实时定量PCR扩增仪检测。扩增参数：95℃预变性10 s；95℃变性5 s、60℃退火15 s、72℃拉伸15 s，进45个循环。以GAPDH为参照基因，计算模型组与对照组的相对基因拷贝数。相对基因拷贝数用2-△△ct表达。采用软件Beacon Designer 7.0设计α和β1亚单位的PCR引物，保证相关引物的GC含量40%～60%，Tm值在55～65℃，且引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列以及正反向引物间尽量避免出现互补序列。见表1。

表1 α和β1亚单位的mRNA引物序列

1.3统计学方法

采用SPSS l9.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1T2DM大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹血胰岛素测定结果

图1　8周、12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa ɑ蛋白的图像表达

腹腔注射STZ8周、12周测定空腹血糖、餐后2 h血糖、血胰岛素，与对照组比较明显升高，血胰岛素敏感指数明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　T2DM大鼠血糖和血胰岛素敏感指数（ISI）的变化（n=10±s）

表2　T2DM大鼠血糖和血胰岛素敏感指数（ISI）的变化（n=10±s）

注：覮与对照组比较，P＜0.05

2.2T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa α、β1亚基蛋白的表达

免疫印迹结果，在8周和12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa α蛋白相对表达量分别为（1.093±0.251）和（0.921±0.153），分别与对照组作两样本均数的t检验，t值分别为1.172和1.633，查t界值表P＞0.1，与对照组比较差异无统计学意义；β1亚基蛋白相对表达量分别为（0.334±0.200）和（0.193±0.310），分别与对照组作两样本均数的t检验，t值分别为10.530和8.232，查t界值表P＜0.01，与对照组比较差异有统计学意义。见图1～4。

2.3T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa α、β1亚基mRNA在血管中的表达

实时定量PCR结果显示，在8、12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα亚基mRNA的表达分别为（1.15±0.13）和（0.92±0.14），分别与对照组作两样本均数的t检验，t值分别为1.9464和1.807，查t界值表P＞0.05，与对照组比较差异无统计学意义；β1亚单位mRNA的表达分别为（0.47± 0.10）和（0.37±0.12），分别与对照组作两样本均数的t检验，t值分别为16.772，16.623，查t界值表P＜0.01，与对照组比较差异有统计学意义，见图5～6。

图2　8周、12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa ɑ蛋白的直方图表达

图3　8周、12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa β1蛋白的图像表达

图4　8周、12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaβ1蛋白的直方图表达

图5　8周、12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa αmRNA的表达变化

图6　8周和12周肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa β1 mRNA的表达变化

3　讨论

糖尿病是心脑血管疾病的独立危险因素，其血管病变主要累及心、脑和外周血管，导致动脉粥样硬化、高血压等疾病，糖尿病患者发生相关血管意外事件的风险是非糖尿病人群的2～4倍［5］，可见2型糖尿病是一种以血管病变为主要致死致残病因的疾病。

血管平滑肌BKCa由孔道形成蛋白α亚基和辅助蛋白β亚基组成，现已鉴别的β亚基有β1-β4个家族成员，其中β1亚基主要分布于动脉平滑肌中。生理条件下，BKCa持续激活可以使细胞膜超极化，抑制电压依赖性钙离子通道的活性，从而导致钙内流减少，对抗平滑肌收缩，阻断BKCa可以使平滑肌收缩。所以BKCa通道是调控血管紧张度的主要离子通道，其通道活性的改变将影响血管的舒缩功能，血管的舒缩异常与通道功能缺陷有关。近年来有关糖尿病与BKCa通道的相关性研究已受到关注［6］。

WANG等［7］发现，T2DM大鼠脑血管平滑肌BKCa活性降低，与其β1亚基的表达下调有关。本研究主要运用免疫印迹法和实时定量PCR技术力图从分子水平阐明T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道是否存在异常，实时定量PCR结果表明β1亚基mRNA在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中表达明显降低，而α亚基mRNA表达无明显变化；免疫印迹结果显示，在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道的β1亚基蛋白表这两种实验技术所得到的结果是一致，即在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道β1亚基发生基因和蛋白水平的明显下调（P＜0.05），而α亚基在基因和蛋白水平无明显变化（P＞0.05）。这提示作为血管平滑肌细胞舒缩功能的重要调节因素，BKCa通道的功能与β1亚基密切相关，β1亚基的低表达可能是导致T2DM血管并发症的一个重要基础。

总之，随着对糖尿病及其离子通道功能异常认识的深入，人们可能对糖尿病血管病变的机制有更新的认识，这将为预防糖尿病的心血管并发症提供新的策略和方法，为糖尿病的综合治疗提供新的靶点，为特异性针对此环节的药物研发提供实验依据。

［1］叶春玲，袁振宇，沈兵.糖尿病小鼠胸主动脉环对血管收缩剂和内皮依赖性舒张剂反应的变化［J］.中国病理生理杂志，2005，21（4）: 788-792.

［2］李尚俭，艾文婷，梁磊，等.胰岛素抵抗对大鼠血管平滑肌细胞BKCa功能的影响［J］.西安交通大学学报（医学版），2011，32（2）:145-150.

［3］张敏敏.2型糖尿病大鼠血管反应性与血管平滑肌上BKCa的相关性研究［D］.四川:泸州医学院，2011.

［4］陈嘉，张永斌，桑传兰，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立及相关指标的测定［J］.动物医学进展，2012，6:91-95.

［5］中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南（2013年版）［J］.中国医学前沿杂志:电子版，2015，3:26-89.

［6］吴宾，陶凌，易甫.糖尿病对冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的影响［J］.国际心血管病杂志，2015，4:245-247.

［7］WANG Y，ZHANG H T，SU X L，et al，Experimental diabetes mellitusdown-regulateslarge-conductanceCa2+activatedK+channels in cerebral artery smooth muscle and alters functional conductance［J］.Curr Neurovasc Res，2010，7（2）:75-84.

（张蕾编辑）

Expression changes of α，β1 subunit protein and mRNA of largeconductance calcium-activated potassium channels in mesenteric arterial smooth muscle cells of type 2 diabetes mellitus rats*

Hong-xia Duan，Li Ge，Chuan-bao Cui，Zhi-gui Wu，Mei-juan Chen
（College of Pharmacy，Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To explore the expression changes of α and β1 subunit protein and mRNA of the largeconductance calcium-activated potassium channels（BK Ca）in mesenteric arterial smooth muscle cells of type 2 diabetes mellitus（T2DM）rats，and to elucidate the specific mechanism of BK Ca channel activity in T2DM mesenteric arterial smooth muscle cells from the molecular level，and to provide new targets for the comprehensive treatment of T2DM and the experimental basis for the specific needle to the drug research and development.Methods After one-month high glucose and high fat diet，SD rats were treated with intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ 25 mg/kg）to establish a rat model of type 2 diabetes mellitus.Western blot and real-time PCR were used to detect α and β1 subunit protein and mRNA expression levels.Results Western blot showed that α subunit protein expressions of mesenteric artery BK Ca channel in model group at 8 and 12 weeks were（1.093±0.251）and（0.921±0.153）respectively，and had no statistical significance compared with the control group（P＞0.05）.Expressions of β1 subunit protein in model group at 8 and 12 weeks were（0.334±0.200）and（0.193±0.310）respectively.There was statistical significance compared with the control group（P＜0.05）.Real-time quantitative PCR results showed that α subunit mRNA expressions of mesenteric artery BK Ca channel in model group at 8 and 12 weeks were（1.15±0.03）and（0.92±0.04），and had no statistical significance compared with the control group（P＞0.05）.Expressions of β1 subunit mRNA were（0.47±0.10）and（0.37±0.12），which were significantly reduced comparing with the control group（P＜0.05）.Conclusions Expressions of β1 subunit protein and mRNA of BK Ca channel in mesenteric artery are decreased significantly in T2DM rats at 8 and 12 weeks.

type 2 diabetes mellitus；large-conductance calcium-activated potassium channels；mesenteric artery；α，β1 subunit

R-332；R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.001

1005-8982（2016）16-0001-05

2016-03-25

四川省教育厅重点项目基金（No：11ZA242）［通信作者］陈美娟，E-mail：chenmeijuan1969@sina.com