零原核胚胎利用价值的探讨

陈国勇，刘芸，张群芳，黄吴键，林春丽

(南京军区福州总医院妇产科，福州　350025)



零原核胚胎利用价值的探讨

陈国勇，刘芸*，张群芳，黄吴键，林春丽

(南京军区福州总医院妇产科，福州350025)

目的比较未见原核(0PN)与正常原核(2PN)来源优质囊胚的妊娠结局，探讨0PN胚胎的利用价值。方法收集2013年1月至2014年12月在本中心行助孕治疗、鲜胚移植失败或取消移植后行冻融优质囊胚移植的784例患者为研究对象，以移植0PN来源冻融优质囊胚的患者为0PN组，移植2PN来源冻融优质囊胚的患者为2PN组，分析0PN、2PN卵裂胚的优质囊胚形成率，并比较两组患者的胚胎种植率、临床妊娠率和流产率等。结果0PN卵裂胚的总优质囊胚形成率显著低于2PN卵裂胚(37.17% vs. 44.49%)，但第3天卵裂球8细胞以上胚胎优质囊胚形成率0PN胚胎显著高于2PN胚胎(67.45% vs. 57.16%)(P均<0.01)。囊胚移植后0PN组的种植率(71.15% vs. 53.74%)、临床妊娠率(80.00% vs. 64.32%)、抱婴率(68.00% vs. 55.71%)显著高于2PN组(P均<0.05)；两组出生婴儿体重、身长、Apgar评分、畸形率等比较无显著性差异(P>0.05)。结论0PN来源优质囊胚的利用价值值得关注。0PN胚胎可能只是在设定的观察时间内未观察到原核，而并不一定是异常受精。对于无可利用优质胚胎的患者，临床上可以将0PN胚胎继续培养至囊胚，然后进行移植，以提高患者的胚胎利用率和临床妊娠率。但因为0PN胚胎存在染色体异常的可能性仍较大，建议能结合遗传学筛查技术，以获得更确切的信息，指导临床应用。

原核；细胞数；优质囊胚形成率；种植率；临床妊娠率

【Abstract】

Objective： To compare the pregnancy outcome of high-quality blastocyst from two pronucleus (2PN) or zero pronucleus (0PN) embryos，and further analyze the value of zero pronucleus embryos.

Methods： A total of 784 patients with frozen-thawed transfer with high-quality blastocyst after fresh embryo transfer failure or cancel of transfer cycle in our center from Jan. 2013 to Dec. 2014 were enrolled for the study. The patients were divided into two groups according to the high-quality blastocyst derived from 0PN or 2PN embryos： the 0PN-derived group and the 2PN-derived group. The high-quality blastocyst rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and miscarriage rate were compared between the two groups.

Results： In general，the high-quality blastocyst rate from 0PN-derived embryo was significantly lower than that from 2PN-derived embryo (37.17% vs. 44.49%，P<0.01)，but the rate of high-quality blastocyst with more than 8 cells derived from 0PN embryo on Day 3 was significantly higher than that from 2 PN embryo (67.45% vs.57.16%，P<0.01). The implantation rate (71.15% vs.53.74%)，clinical pregnancy rate (80.00% vs. 64.32%) and live birth rate (68.00% vs. 55.71%) in 0PN-derived embryo group were significantly higher than those in the 2PN-derived embryo group(allP<0.05). The birth weight，Apgar score，and malformation rate were not significantly different between the two groups (P>0.05).

Conclusions： It is worthy to utilize high-quality blastocyst derived from 0PN embryos. For patients without high quality embryos to use，their 0PN embryos can be cultured to blastocyst and then transplant，in order to improve the embryos utilization rate and clinical pregnancy rate.

(JReprodMed2016，25(8)：696-700)

辅助生殖助孕治疗中，胚胎培养在原核观察期就已经表现出多样性，多原核胚胎一般作为废弃胚胎被销毁，正常受精的2原核(2PN)胚胎则继续培养，但未观察到原核(0PN)、仅观察到1原核(1PN)胚胎的利用情况仍然存在争议[1]。现就本中心0PN胚胎的利用情况进行探讨，以期为临床应用提供一定参考。

资料与方法

一、研究对象及分组

收集2013年1月至2014年12月在本中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗、有囊胚培养的1 583例患者(共7 765个胚胎)的临床资料。选择其中鲜胚移植失败或取消移植，而后行解冻后优质囊胚移植的784例患者为研究对象。

分组情况：无2PN来源优质囊胚，行0PN来源优质囊胚解冻后移植的患者为0PN组；行2PN来源优质囊胚解冻后移植的患者为2PN组。本研究中0PN胚胎指授精后16～18 h观察到明确2极体(2PB)、0PN但第3天(D3)有卵裂的胚胎。

二、研究方法

1. 控制性超促排卵：所有患者均采用改良长方案促排卵：于月经D3开始使用达菲林(醋酸曲普瑞林，Triptorelin，3.75 mg/支，博福益普生，法国)约1.31 mg进行垂体降调节，根据患者体重和卵巢情况，使用重组人卵泡刺激素(果纳芬，Gonal-F，75 U/支，默克雪兰诺，瑞士)和人绝经期促性腺激素(HMG，50 U/支，珠海丽珠)进行促排和启动，剂量150～225 U，根据卵泡发育情况调整用药剂量。B超监测卵泡发育情况，观察血清雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、孕酮(P)水平，当3个以上主导卵泡直径达18 mm时肌肉注射重组人绒毛膜促性腺激素(rHCG，默克雪兰诺，德国)250 U和注射用HCG(珠海丽珠)2 000 U，36～38 h后阴道B超引导下行卵泡穿刺取卵。

2. IVF与胚胎处理：取卵后，在体视显微镜下分拣出卵冠丘复合物，置于覆盖矿物油授精液(Vitrolife，瑞典)的四孔板上，置37℃、6%CO2、5% O2培养箱中培养3～4 h，进行短时授精。授精后4～6 h去除卵丘颗粒细胞，观察第二极体产生情况判断是否受精。受精情况达标者换G1培养液(Vitrolife，瑞典)进行单胚胎培养，培养至次晨(授精后16～18 h)观察原核、极体发生情况，以2PN(2PB)为正常受精。D3观察胚胎后，挑选1～2个2PN来源的优质卵裂胚进行移植或冷冻。其余卵裂胚除多原核胚胎遗弃外，均进行囊胚培养，换G2培养液(Vitrolife，瑞典)继续培养36～48 h，观察囊胚生长情况，选择质量较好的囊胚进行冷冻。G1、G2培养均为25 μl/滴，覆盖矿物油，单独培养，培养环境均为37℃、6%CO2、5% O2的培养箱。所有胚胎操作均统一由2名有经验的胚胎操作者完成。

胚胎观察时间：以2010年伊斯坦布尔胚胎共识评估时间点[2]评估胚胎：授精后(17±1)h观察原核(D1)、(68±1)h观察卵裂胚(D3)、[(116/140/164)±2]h观察囊胚生长情况。

胚胎评估方法：以改良的形态学评估方法为标准：(1)卵裂胚评估参考Racowsky、Veeck等的卵裂胚评估办法[3-4]，结合本中心实际操作进行评估。I级：卵裂球大小均匀且碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球大小轻度不均且碎片<20%，或卵裂球大小均匀且碎片10%～20%；Ⅲ级：卵裂球大小严重不均且碎片<50%，或卵裂球无大小严重不均、碎片20%～50%；Ⅳ级：碎片≥50%。(2)优质囊胚评估标准：按Gardner分级标准[5]对囊胚评分，根据囊胚的扩张和孵出程度进行分期，根据内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)评分进行分级，本中心以4BB以上级别囊胚为优质囊胚。

囊胚的冻融及移植：囊胚冷冻均采用玻璃化冷冻法，使用实验室自制的玻璃化冷冻试剂。鲜胚移植失败后，择期行冻融囊胚移植。解冻囊胚，解冻后2 h进行质量评估：囊腔复膨充分，未见明显的ICM、TE退化者视为复苏成功。复苏成功的囊胚换移植液直接进行移植，移植管采用美国COOK移植管，移植液为G2与人血清白蛋白的混合液。

3. 观察指标：观察两组的种植率、妊娠率、流产率及抱婴率；种植率=孕囊数/移植胚数；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植患者例数；流产率=流产例数/妊娠例数；抱婴率=获得活产的患者例数/移植患者例数。

4. 签署知情同意书：与无2PN来源优质囊胚的患者沟通，告知其具体情况及移植0PN来源囊胚可能存在的风险，患者自愿接受0PN来源的优质囊胚解冻移植，签署知情同意书，并建议患者成功妊娠后进行必要的产前诊断与检查。

三、统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析，计量资料组间比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结　　果

一、0PN来源和2PN来源优质囊胚形成情况比较

本研究共收集了869个0PN胚胎进行囊胚培养，共形成优质囊胚323个，优质囊胚形成率为37.17%；同时期收集2PN胚胎共6 896个，继续囊胚培养后形成优质囊胚3 068个，优质囊胚形成率为44.45%。0PN来源优质囊胚形成率显著低于2PN来源优质囊胚形成率(P<0.01)(表1)。

其中D3发育达8细胞以上的0PN胚胎298个，形成优质囊胚201个，优质囊胚形成率67.45%；D3发育达8细胞以上的2PN胚胎1 445个，形成优质囊胚826个，优质囊胚形成率57.16%。0PN组显著高于2PN组(P<0.01)(表1)。

二、两组患者一般情况比较

0PN和2PN两组患者的平均年龄、移植日子宫内膜、移植囊胚数等一般情况比较，均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

三、两组患者的妊娠情况比较

有75例患者移植了解冻的0PN来源优质囊胚，共104个囊胚，最后60例患者获得临床妊娠，见孕囊74个，流产9例。2PN组709例患者移植解冻后的2PN来源优质囊胚，共1 044个囊胚，最后456例患者获得临床妊娠，见孕囊561个，流产61例。0PN组的种植率、临床妊娠率、抱婴率均显著高于2PN组(P<0.05)(表3)。

表1　0PN来源和2PN来源优质囊胚形成情况比较(%)

注：与2PN卵裂胚比较，*P<0.01

表2　两组患者一般情况比较(x-±s)

表3　两组患者的妊娠情况比较(%)

注：与2PN组比较，*P<0.05，**P<0.01

四、两组患者出生婴儿随访情况比较

两组出生婴儿的出生孕周、体重、身长、Apgar评分、畸形率等比较，均无显著性差异(P>0.05)(表4)。2PN组出生婴儿中有7例合并先天性畸形：2例先心病，1例先心病合并左侧断掌，1例蚕豆病，1例轻度唇腭裂，1例先天性膈疝，1例双足内翻畸形；0PN组出生婴儿中有1例先天畸形婴儿，为左耳轻度畸形合并单肾畸形。

表4　两组患者出生婴儿情况比较 [(x-±s)，%]

讨　　论

胚胎的评估选择一直是辅助生殖技术领域热门的话题之一[2，6]，目前胚胎评价仍无严格统一的标准，学者们在这个领域进行了大量的相关研究，目前最常用的方法有形态学评估[3，6-7]，其他还有通过胚胎代谢产物检测[8-9]、胚胎细胞活检染色体检查[10]、免疫或激素类物质测定[11-12]，以及红外光辅助分析优选胚胎[13]、实时成像技术(time lapes)[14-15]等方法来评估胚胎质量。胚胎形态学评价作为辅助生殖领域临床常规的评估方法，在IVF-ET等助孕治疗中得到了广泛应用，通常根据早期卵裂、D2或D3卵裂情况来综合评价胚胎质量，以选择优质胚胎进行移植，以期提高临床妊娠率。

受精是精子进入卵母细胞并与之融合的过程，精子的进入诱导第二极体排出，精子来源的染色体解聚，形成雄原核，卵母细胞形成雌原核。在精子和卵母细胞共培养16～18 h间观察(主要集中在约18 h)，可见雌原核和雄原核的视为正常受精。临床实践中有部分病例在精卵共培养16～18 h后进行观察时，未能见到原核但能观察到2PB，继续培养至D2、D3时仍可观察到卵裂，即0PN胚胎，甚至再继续培养后，这部分0PN胚胎可以继续发育为囊胚[16-17]。分析其原因，有可能0PN来源胚胎其原核形成时间出现了提前或推迟，即原核出现时间并不在16～18 h范围内，因此在设定的观察时间里未能观察到原核，但继续培养再观察时可以观察到卵裂。已有研究报道，这类0PN来源的囊胚移植后，也可正常发育甚至分娩正常新生儿[18-19]。

本研究结果显示，在同一时期临床及实验室各项条件均稳定的情况下，0PN胚胎占受精胚胎总数(含0PN)的比例约为3%～5%，0PN胚胎继续培养后可以发育至囊胚，虽然优质囊胚的形成率要低于正常受精的2PN胚胎，但仍大大提高了卵母细胞的整体利用率。

关于0PN胚胎的发育潜能，Wang等[20]、曾勇等[21]曾研究报道0PN胚胎不如正常受精胚胎。本研究结果显示，0PN来源的优质囊胚形成率显著低于2PN来源者(37.17% vs. 44.45%，P<0.05)，与前述研究结果[20-21]一致。但进一步分析D3卵裂胚卵裂球数量≥8个的胚胎优质囊胚形成率，发现0PN来源的优质囊胚形成率显著高于2PN来源者(67.45% vs. 57.16%，P<0.05)，提示发育速度较慢的0PN来源胚胎优质囊胚形成率相对较低，这与之前的研究报道[10，21]结果相近，之前Seli等[10]、曾勇等[21]提出发育速度慢的胚胎染色体数目或结构异常的比例较大，相比正常胚胎发育潜能要低。推测发育潜能好的0PN胚胎可能其原核消失时间早于我们设定的观察期，即胚胎发育速度提前，其发育潜能可能类似受精卵发生早期卵裂，是发育潜能较好的表现，但这尚需进一步的研究探讨。

0PN来源胚胎在D3胚胎移植时，一般不能被选择移植，但对于可利用胚胎稀少的患者，又恐丢弃了有正常发育潜能的胚胎，因此，将这些胚胎进一步培养至5～6 d囊胚阶段，如果发育成优质囊胚，则认为有进一步使用的价值。本研究中有75例患者在签署知情同意书后移植了0PN来源的优质囊胚，60例患者获得妊娠，临床妊娠率为80%，甚至高于2PN组患者的临床妊娠率(P<0.01)，这可能与本研究纳入患者数量较少，数据存在一定的偏倚有关，后期尚需收集更大样本量进行对照研究，以进一步探讨验证。本研究中0PN组流产率15%，随访出生婴儿情况未见明显差异，出生婴儿62例中仅有1例有左耳畸形合并单肾畸形，畸形发生率与移植2PN来源优质囊胚的患者比较无显著性差异(P>0.05)，提示部分0PN来源的优质囊胚亦可能具有良好的发育潜能。

综上所述，临床上对于无可利用优质胚胎的患者，可以选择继续培养0PN胚胎至囊胚期，选择发育成优质囊胚的胚胎进行移植，以提高患者的胚胎利用率和临床妊娠率。但因为0PN胚胎存在染色体异常的可能性仍较大，临床上胚胎移植前如能结合遗传学筛查技术，将可获得更确切的信息，指导临床应用。且本研究所纳入样本量较少，可能存在一定偏倚，后期需要进一步扩大样本量观察，以得出更科学、可信的结论。

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[编辑：王慧萍]

Analysis of value of zero pronuclear embryos

CHEN Guo-yong，LIU Yun*，ZHANG Qun-fang，HUANG Wu-jian，LIN Chun-li

DepartmentofGynecology，FuzhouGeneralHospitalofNanjingCommand，Fuzhou350025

Pronucleus；Cell number；High-quality blastocyst rate；Implantation rate；Clinical pregnancy rate

2015-12-30；

2016-01-19

南京军区医药卫生科研基金课题(12Z37)

陈国勇，男，广东翁源人，本科，医师，生殖医学专业.(*

，Email：liuyunfj@126.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.006