18-β-甘草次酸衍生物的合成与体外抗HBV活性研究*

孙航宇，欧小洪，孙薛蛟，曾丽兰，王　欢，董登祥

(贵阳中医学院，贵州　贵阳　550025)



18-β-甘草次酸衍生物的合成与体外抗HBV活性研究*

孙航宇，欧小洪，孙薛蛟，曾丽兰，王欢，董登祥▲

(贵阳中医学院，贵州贵阳550025)

本文合成18-β-甘草次酸衍生物4个，采用MT法测定其18-β-甘草次酸衍生物的抗HBV活性。再进行样品抑制HepG2.2.15细胞表达表面抗原(HBsAg)的测试。通过测试样品GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10对HBsAg的分泌表达有一定的抑制作用。

18-β-甘草次酸衍生物，抗HBV，生物活性，糖化学

甘草是一味应用极其广泛的中药材，具有补心脾气、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药、缓和药性等功效[1-2]。国内外科研工作者已从甘草中分离了100多种黄酮类化合物、18种氨基酸、60多种三萜及香豆素类化合物、多种生物碱、雌性激素以及有机酸等[3-4]。其中有效成分18-β-甘草次酸具有抗炎、抗病毒(肝炎病毒、艾滋病毒、非典病毒等)、抗溃疡、抗过敏、抗肿瘤等多方面的作用[5-6]。但是，该类药物长期服用可引起类醛固酮增多症，从而导致水肿、高血压、四肢瘫痪和低血钾症[7-8]。另外，也有报道甘草次酸对动物甲状腺有中度抑制和降低基础代谢率的作用[9]。

水溶性差以及高浓度时对正常细胞的毒性作用制约了其在临床上的广泛应用。本文通过向18-β-甘草次酸引入基团或糖片段，降低甘草次酸的副作用，改善甘草次酸的溶解性和可吸收性，进而筛选出经济、稳定、高活性的18-β-甘草次酸类药物便于临床应用。

1　仪器与试药

Heidolph-4000旋转蒸发仪、DF-Ⅱ集热式磁力搅拌器、PSL-1800磁力搅拌低温恒温水槽、WFH-203B三用紫外分析仪、MA110电子天平。其余由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心提供。

18-β-甘草次酸、D-(+)-半乳糖、D-乳糖、D-葡萄糖、D-(+)-氨基葡萄糖盐酸盐；化学试剂为市售分析纯；其余由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心提供。

2　方法

2.1合成路线(图1)

图1Fig.1

2.218-β-甘草次酸衍生物合成

以化合物18-β-甘草次酸为起始原料，经乙酰化途径，合成化合物3-O-乙酰基-18-β-甘草次酸甲酯a。

2.2.1衍生物GLY-1合成

称取80 mg(0.16 mmol)化合物 a 于圆底烧瓶中，加入4 mL Py和2 mL Ac2O，室温搅拌3 h，经TLC检测反应完成，调pH至中性，用DCM萃取，再用无水MgSO4干燥，浓缩经硅胶柱层析(Cy∶EtOAc = 2∶1)，得到化合物GLY-1。

波谱数据：ESI-MSm/z：549.3[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ(ppm)：5.67(s，1H，H-12)，4.58-4.47(m，1H，H-3)，3.69(s，3H，-COOCH3)，2.80(1H，H-9)，2.05(s，3H，-OOCCH3)，2.03-1.58(m，12H，H-21，H-18，H-19，H-2，H-19，H-1，H-7，H-22，H-6，H-5)，1.49-1.42(s，3H，20-CH3)，1.40 -1.27(m，11H，H-15，H-16，H-1，H-22，H-7，27-CH3，H-6，H-15，H-16)，1.19 -0.76(m，15H，25、26、28、23、24-CH3)；13C-NMR(101 MHz，CDCl3)δ(ppm)：200.12(C-11)，176.94(C-30)，171.03(C-18)，169.28(-COOCH3)，128.45(C-12)，80.60(C-3)，61.69(C-9)，54.98(C-5)，51.79(-COOCH3)，48.39(C-18)，45.38(C-8)，44.03(C-20)，43.16(C-14)，41.02(C-19)，38.75(C-4)，38.02(C-1)，37.71(C-10)，36.90(C-22)，32.66(C-7)，31.82(C-17)，31.10(C-21)，29.68(C-29)，28.41(C-16)，28.02(C-28)，26.40(C-15)，23.54(C-27)，23.31(C-2)，21.32(C-23，C-24)，18.64(-OOCCH3)，17.35(C-6)，16.67(C-25)，16.41(C-26).

2.2.2衍生物GLY-5合成

以D-吡喃葡萄糖为起始原料，经全乙酰化等步骤，合成中间体片段2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酸酯 b 。

称取100 mg(0.20 mmol)化合物 b 和147 mg(0.30 mmol)化合物 a 与圆底烧瓶中，加入适量的DCM使其溶解，冰水平衡10 min后加入30 μL的BF3·Et2O，经TLC检测反应完成，调pH至中性，用DCM萃取，再用无水MgSO4干燥，浓缩经硅胶柱层析(Cy∶EtOAc = 1∶1)，得到化合物 c ，取化合物 c 加入约5 mL MeOH溶液使其溶解，再缓慢加入新制的MeONa溶液，保持反应体系在PH = 11～13之间，室温搅拌反应，经TLC检测反应完成，调PH = 6，浓缩过柱纯化，得化合物GLY-5。

波谱数据：ESI-MSm/z：669.3[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：5.54(s，1H，H-12)， 4.29(d，J = 8.1 Hz，1H，H-1’)，3.82-3.18(m，10H，H-6’，H-5’，H-2’，H-3’，H-4’，H-2’，3’，4’，6’-OH)，3.71-3.66(s，3H，-COOCH3)，2.73-2.62(m，1H，H-3)，2.44(s，1H，H-9)，2.14(2H，H-21)，1.96(1H，H-18)，1.84(m，2H，H-19)，1.73(m，2H，H-2)，1.61 -1.35(m，7H，H-1，H-7，H-22，H-6)，1.35-1.18(m，6H，H-29，H-5，H-15)，1.18-1.09(m，9H，H-28，H-25，H-26)，1.07-1.02(m，5H，H-16，H-27)，0.89(m，1H，H-6)，0.86(s，3H，H-23)，0.81(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：202.59(C-11)，178.58(C-30)，172.61(C-13)，128.94(C-12)，107.33(C-1’)，90.38(C-3)，76.33(C-5’)，75.14(C-3’)，73.10(C-2’)，70.21(C-4’)，63.15(C-6’)，62.33(C-9)，56.48(C-5)，52.33(-COOCH3)，48.35(C-18)，46.74(C-8)，45.30(C-20)，44.58(C-19)，42.48(C-14)，42.31(C-4)，40.52(C-1)，40.23(C-10)，38.98(C-22)，38.07(C-7)，33.78(C-17)，32.96(C-21)，31.98(C-29)，29.13(C-16)，28.50(C-28)，27.54(C-15)，27.33(C-27)，27.05(C-2)，23.80(C-23，C-24)，19.25(C-6)，18.43(C-25)，16.98(C-26).

2.2.3衍生物GLY-9合成

以D-乳糖为起始原料，经全乙酰化等步骤，合成中间体片段2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亚胺酸酯d。

以D-乳糖为起始原料，经全乙酰化、硫苷化等步骤，合成中间体片段对甲基-苯基-S-(2，6-二-O-苄基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-苄基-D-吡喃葡萄糖苷e。

以化合物d和化合物e为起始原料，DCM为溶剂，TMSOTf为催化剂，合成中间体片段对甲基-苯基-S-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，6-二-O-苄基-β-D-吡喃半乳糖基]-(1→4)-2，3，6-三-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷f。

称取100 mg(0.06 mmol)化合物f和35 mg(0.07 mmol)化合物a与圆底烧瓶中，再加入27 mg NIS和100 mg 4Å Ms，加入适量的DCM使其溶解，冰水平衡10 min后加入1.0 μL的TfOH，经TLC检测反应完成，调PH至中性，用DCM萃取三次，再用无水MgSO4干燥，浓缩经硅胶柱层析(Cy∶EtOAc = 2∶1)，得到化合物g，取化合物g加入5 mL MeOH溶液使其溶解，再缓慢加入新制的MeONa溶液，保持反应体系在PH = 11～13之间，室温搅拌反应，经TLC检测反应完成，调PH = 6左右，浓缩过柱纯化，得化合物GLY-9。

波谱数据：ESI-MSm/z：1605.7[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 7.52 -7.13(25H，Ar-H)，5.68(s，1H，H-12)，5.14- 4.97(2H，H-1’，H-1’’)，4.95- 4.89(2H，H-1’’’，H-1’’’’)，4.78-4.37(10H，Ph-CH2-)，4.37- 4.23(2H，H-5’，H-5’’)，4.06-3.99(1H，H-5’’’)，3.94 -3.84(4H，H-3’’，H-6’’’，H-6’’’’，H-5’’’’)，3.84 -3.76(3H，H-2’’’，H-3’’’，H-2’’’’)，3.76-3.15(25H，-COOCH3，H-6’，H-6’’，H-3’’，2’’’，3’’’，6’’’，2’’’’，3’’’’，4’’’’，6’’’’-OH，H-2’，H-3’，H-6’’’，H-6’’’’，H-3’’’’，H-4’’’’，H-2’’，H-4’，H-4’’，H-4’’’)，2.82-2.66(1H，H-3)，2.39(1H，H-9)，2.19-1.76( 6H，H-21，H-18，H-19，H-2)，1.76-1.15(17H，H-22，H-1，H-7，H-6，H-2，H-5，H-15，H-29，H-16)，1.13(s，3H，H-27)，1.07-0.79(9H，H-25，H-26，H-28)，0.56(s，3H，H-23)，0.47(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 202.41(C-11)，178.55(C-30)，172.54(C-13)，141.46 - 127.57(31C，Ar-C，C-12)，106.61 - 94.96(C-1’，C-1’’，C-1’’’，C-1’’’’)，90.28(C-3)，84.80(C-3’)，84.31(C-4’’)，83.35(C-4’’’)，82.12(C-2’)，81.19(C-2’’)，81.07 - 78.46(C-5’’’’，C-5’’’)，78.07(C-4’)，77.10(C-5’)，76.81(C-3’’’’)，75.64 - 72.92(10C，C-3’’，C-2’’’，C-5’’，C-2’’’’，C-3’’’，5个Ph-CH2-)，72.92 - 71.81(C-4’’’’)，71.19-69.65(C-6’，C-6’’)，62.55(C-6’’’)，62.53(C-6’’’’)，61.65(C-9)，56.79(C-5)，52.34(-COOCH3)，48.36(C-18)，46.75(C-8)，45.27(C-20)，44.57(C-19)，42.48(C-14)，42.28(C-4)，40.03(C-1)，39.54(C-10)，38.96(C-22)，38.18(C-7)，33.78(C-17)，32.94(C-21)，31.95(C-29)，29.15(C-16)，28.80(C-28)，28.52(C-15)，27.73 - 27.58(C-27)，27.42(C-2)，24.08(C-23)，23.84(C-24)，19.29(C-6)，18.61(C-25)，17.22(C-26).

2.2.4衍生物GLY-10合成

以D-吡喃半乳糖为起始原料，经全乙酰化、硫苷化等步骤，合成中间体片段对甲基-苯基-S-2，6-二-O-苄基-D-吡喃半乳糖苷h。

以化合物d和化合物h为起始原料，DCM为溶剂，TMSOTf为催化剂，合成中间体片段对甲基-苯基-S-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-(1→4)-2，6-二-O-苄基-D-吡喃半乳糖苷i。

以化合物i和化合物a为起始原料，GLY-10的合成方法跟GLY-9相同。

波谱数据：ESI-MSm/z：1173.5[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 7.52 -7.13(10H，Ar-H)，5.62(s，1H，H-12)，5.26(d，1H，H-1’)，5.26-4.99(2H，H-1’’，H-1’’’)，4.80 -4.35(4H，Ph-CH2-)，4.26-3.96(2H，H-5’，H-5’’)，3.96-3.84(1H，H-3’)，3.84-3.77(2H，H-6’’，H-6’’’)，3.75-3.12(24H，H-5’’’，H-2’’，H-2’’’，H-3’’，H-6’’，6’’’，3’，2’’，3’’，2’’’，3’’’，4’’’-OH，H-6’，H-6’’’，H-3’’’，H-4’’’，H-2’，H-4’，H-4’’，-COOCH3)，2.78-2.63(1H，H-3)，2.39(1H，H-9)，2.19-1.76( 6H，H-21，H-18，H-19，H-2)，1.76-1.15(17H，H-22，H-1，H-7，H-6，H-2，H-5，H-15，H-29，H-16)，1.13(s，3H，H-27)，1.07-0.79(9H，H-25，H-26，H-28)，0.56(s，3H，H-23)，0.47(s，3H，H-24)；13C-NMR(101 MHz，CD3OD)δ(ppm)：δ 202.61(C-11)，178.63(C-30)，172.70(C-13)，139.91-127.37(13C，Ar-C，C-12)，109.97- 105.22(3C，C-1’，C-2’’，C-3’’’)，92.18(C-3)，83.70-81.05(2C，C-4’，C-4’’)，80.86- 80.08(3C，C-2’，C-5’’’，C-5’’)，77.04(C-3’’’)，76.59 -74.58(7C，C-3’，C-2’’，C-5’，C-2’’’，C-3’’，2×Ph-CH2-)，72.7771.16(C-4’’’)，70.84(C-6’)，63.65-62.88(2C，C-6’’，C-6’’’)，61.26(C-9)，56.79(C-5)，52.34(-COOCH3)，48.36(C-18)，46.75(C-8)，45.27(C-20)，44.57(C-19)，42.48(C-14)，42.28(C-4)，40.03(C-1)，39.54(C-10)，38.96(C-22)，38.18(C-7)，33.78(C-17)，32.94(C-21)，31.95(C-29)，29.15(C-16)，28.80(C-28)，28.52(C-15)，27.73-27.58(C-27)，27.42(C-2)，24.08(C-23)，23.84(C-24)，19.29(C-6)，18.61(C-25)，17.22(C-26).

2.3活性测定

首先用MTT法评价样品在预设浓度下对细胞生长的抑制程度，确定合适的样品浓度，再进行样品抑制HepG2.2.15细胞表达表面抗原(HBsAg)的测试。通过计算样品对HBsAg表达的抑制率来评价样品活性。

计算公式：

1)样品对细胞活力的抑制率(%)= [(对照组的OD值-样品组的OD值)/ 对照组的OD值]×100

2)样品对表面抗原的抑制率(%)=[(对照组的OD值-样品组的OD值)/ 对照组的OD值]×100

2.4测定结果(表1)

表1　筛选结果Tab.1　screening results

注：活性实验由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心完成。

3　结果和讨论

化合物GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10的体外抗HBV活性见表1。样品GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10对HBsAg的分泌表达有弱的抑制作用。

本实验通过体外抗HBV活性评价虽然表现出抑制作用较弱，与商品化拉米夫定有一定的差距，但是初步实验只能说明体外的活性作用稍弱。考虑到糖苷在体内的降解过程中还会在不同时段和部位释放出具有药理活性的苷元，我们还将进一步将通过动物实验来分析体内药动学及药效学的关系、释药时间及体内代谢情况对活性的影响来说明。本文对进一步研究提供了一定的研究基础。

【REFERENCES】

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Synthesis of 18-β-glycyrrhetinic acid derivatives and their anti-HBV activity in vitro*

SUN Hangyu，OU Xiaohong，SUN Xuejiao，ZENG Lilan，WANG Huan，DONG Dengxiang▲

(GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang，Guizhou550025，China)

Four 18-β-glycyrrhetinic acid derivatives were synthesized by carbohydrate chemistry modification，and the anti-HBV activities of these compounds were determined by MTT method.Their inhibition abilities on HepG2.2.15 cells expressing HBsAg were tested.The results showed that GLY-1、GLY-5、GLY-9、GLY-10 have certain inhibitory effect on the secretory expression of HBsAg.

18-β-glycyrrhetinic acid derivatives，anti-HBV，bioactivity，carbohydrate chemistry

R979.9

A

1003-6563(2016)04-0001-04

2016-06-07；

2016-06-14

黔科合院士站(2014)4013；省长基金(2070201-040-070857)。

孙航宇(1989-)，男，在读硕士，研究方向：中药、民族药化学及新药研究。

▲董登祥(1962-)，男，副教授，研究方向：药物化学。