温和灸对大鼠后三里穴局部形态及CGRP、SP、VIP表达的影响*

李　梅，王耀帅，王应越南京中医药大学第二临床医学院，江苏南京210023



温和灸对大鼠后三里穴局部形态及CGRP、SP、VIP表达的影响*

李梅，王耀帅△，王应越
南京中医药大学第二临床医学院，江苏南京210023

目的：探讨温和灸对大鼠后三里穴施灸局部的温通效应及生物学基础。方法：以高脂血症模型大鼠后三里穴为观察对象，运用HE染色法和免疫组化法，观察温和灸热刺激下，后三里穴局部皮肤形态结构以及皮肤组织中降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）表达的变化。结果：温和灸组与对照组比较，后三里穴局部皮肤组织形态结构明显发生变化，角化层极薄或消失，表皮层断裂不完整，真皮层胶原纤维排列疏松；施灸后穴位局部皮肤CGRP较多表达在真皮层结缔组织，SP较多表达在毛囊，VIP较多表达在真皮层结缔组织以及表皮中。结论：温和灸热刺激可以改变后三里穴局部形态结构、影响后三里穴局部皮肤中CGRP、SP、VIP的分布表达，这些效应可能与艾灸以温促通的生物学基础相关。

温和灸；后三里；降钙素基因相关肽；P物质；血管活性肠肽

艾灸是以艾为主要材料，点燃后在体表穴位或病变部位烧灼、温熨，借助其温热刺激作用，起到温通气血、扶正祛邪等防病保健的功效［1-3］。体表皮肤是艾灸刺激的直接作用部位，局部皮肤适宜温热刺激的选择、刺激的反应特征及启动相关调节机制的过程均以皮肤的生物学特征为基础，也就是说研究艾灸的效应规律和作用原理，并不是只研究艾灸本身的特征，还要研究它的作用对象的特征。本研究以高脂血症大鼠为模型，观察温和灸热刺激对后三里穴施灸局部皮肤的形态，以及局部皮肤降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）等神经肽阳性表达的影响，探讨温和灸局部的温通效应及以温促通作用的生物学基础。

1　材料与方法

1.1实验动物选用雄性SD大鼠，体质量（180± 10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005，饲养于南京中医药大学实验动物中心（清洁级），采取高脂饲料喂养8周，造成高脂血症大鼠模型。

1.2实验器材定制直径7 mm动物用清艾灸条（南阳汉医艾绒有限责任公司）、液状石蜡、中性树胶（均由上海标本模型厂提供）、甲醛、二甲苯、无水乙醇（均由南京宁试化学试剂有限公司提供）、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐抗原修复液、DAB显色试剂盒（均由福州迈新生物技术开发有限公司提供）、兔抗大鼠CGRP多克隆抗体、兔抗大鼠SP多克隆抗体、兔抗大鼠VIP多克隆抗体（均由武汉博士德生物技术有限公司提供）。TP1020型全自动组织处理仪（由德国LEICA公司提供）、RM2145型石蜡切片机（由德国LEICA公司提供）、BX60型光学显微镜（由日本OLYMPUS公司提供）、DP71型图像获取系统（由日本OLYMPUS公司提供）、CMIAS98A型图像分析仪（由北京航空航天大学提供）、图像分析软件（由南京大学捷达公司提供）。

1.3实验方法

1.3.1实验分组将造模成功的大鼠随机分为对照组和温和灸干预组，每组8只。

1.3.2干预方法造模成功后，温和灸组大鼠施以10 min/d，共2周的温和灸治疗。将大鼠双侧后三里穴区1 cm×2 cm鼠毛剪除，暴露局部皮肤组织，酒精棉球消毒。用自制固定夹仰卧位固定大鼠，待大鼠安静不挣扎后，使用直径7 mm的艾条，以大鼠无挣扎行为的距离调节艾条与皮肤的距离，施灸于后三里穴进行治疗。后三里穴位于膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处［1］。治疗期间，对照组以同样方法抓取固定，不做艾灸治疗。实验期间所有大鼠同等条件下喂养。

1.3.3HE染色及免疫组化完成治疗后，禁食12小时后，取血、取材。取大鼠后三里穴局部长8 mm、宽6 mm、厚3 mm的组织，使标记点在正中间，用预冷的4℃生理盐水冲洗后，放入10%甲醛中固定。将固定好的皮肤组织进行修块石蜡包埋。HE染色：石蜡切片脱蜡脱水；苏木素染液染色5分钟；快速放入1%盐酸乙醇中进行分化；用清水洗涤后，放入促反蓝液中10分钟；返蓝结束后，梯度酒精上行脱水；二甲苯透明；树胶封片。免疫组化：取石蜡切片，置烤箱60℃2小时以使切片紧密黏附。二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，PBS洗，3分钟×3次；3%H2O2室温孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶；柠檬酸盐抗原修复液室温孵育20分钟；滴加5%BSA封闭液，室温10分钟，甩去多余液体，不洗；滴加兔抗鼠CGRP（SP、VIP）多克隆抗体，置37℃温箱孵育1.5小时。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔IgG，置37℃温箱孵育45分钟；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；DAB显色，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。

1.3.4图像采集指标观测用光学显微镜观察玻片上组织的形态，找到有效信息，CGRP、SP、VIP阳性显色为棕黄色或棕褐色颗粒，再用摄像仪进行图像的拍摄，拍摄倍数为10×10，然后用图像分析仪及形态学图像分析系统将获取的图像信息进行处理分析。

2　结果

2.1H E染色对照组后三里穴位局部角化层薄，表皮结构完整，基底层、棘层以及颗粒细胞层都未见异常改变，连续真皮层结构正常，胶原纤维束排列致密，染色呈鲜明红色，其间可见毛囊、皮脂腺分布，皮下组织结构正常（图1A）。温和灸组施灸局部皮肤组织形态结构明显发生变化，角化层极薄或消失，表皮层断裂不完整，真皮层胶原纤维排列疏松（图1B）。

图1　后三里穴局部皮肤形态结构（HE染色，×100）

2.2免疫组化CGRP、SP、VIP阳性显色为棕黄色或棕褐色颗粒，信号越强则颜色越深。对照组皮肤组织中可见CGRP表达，温和灸组CGRP主要表达在真皮层结缔组织；对照组皮肤组织中可见SP表达，温和灸组SP主要表达在毛囊；对照组皮肤组织中可见VIP表达，温和灸组VIP主要表达在真皮层结缔组织，表皮层也有表达，见图2-4。

图2　后三里穴局部皮肤CGRP表达结果（免疫组化，×100）

图3　后三里穴局部皮肤SP表达结果（免疫组化，×100）

图4　后三里穴局部皮肤VIP表达结果（免疫组化，×100）

3　讨论

在艾灸治疗的过程中，温度是重要的生物物理因素之一［4-6］。艾灸燃烧时产生的热量通过腧穴局部传入体内，温通效应不仅涉及到表皮，还影响到皮下和肌层。我们的实验结果提示，温和灸的热刺激对施灸局部的温通效应体现在改变了施灸穴位局部皮肤的形态结构，同时影响了皮肤组织内的CGRP、SP、VIP等生物活性物质的分泌和表达，这对于研究针灸刺激体表启动靶器官效应的独特机制有重要意义。基于皮肤的神经-免疫-内分泌的相关生物学新知识［7-10］，为研究艾灸以温促通作用机制的生物学基础提供了启示。艾灸的温通作用可以引发局部的神经源性炎症，而神经源性炎症发病过程中的重要介质包括兴奋性神经递质如速激肽（如P物质、神经激肽A）、降钙素基因相关肽（CGRP）及抑制性神经递质为VIP、一氧化氮（NO）等。有报道［11］指出SP是神经源性炎症的生物标志物，是触发神经源性炎症的重要物质。SP具有传递皮肤感觉信息、扩张血管、促进细胞增殖、诱发局部炎性作用及影响免疫系统等功能。SP激发瀑布式炎症反应，最终可能使局部炎症通过神经机制的介导而扩展［12］。肥大细胞自身能分泌SP，释放出的SP，又可促使肥大细胞进一步释放出大量的炎症介质，形成正反馈调节，扩大炎症反应。CGRP的外周生物学作用广泛，是已知最强烈的血管舒张剂。CGRP可抑制SP酶的降解过程，同时也促进SP从初级传入纤维末梢的释放。所以，CGRP可通过增强SP的生物学效应，促进炎症反应的发生。在皮肤，VIP能直接影响血管功能的调节，介导血管舒张和扩散，同时能引起在伤口愈合中起重要作用的胶质形成细胞。VIP可以通过从肥大细胞释放的组胺和缓激肽诱导的水肿来参加神经源性炎症。肥大细胞是神经内分泌肽的重要靶细胞，在某些组织中，肽能神经纤维和肥大细胞在解剖学上紧密相连。刺激神经纤维，可以经肥大细胞介导放大炎症反应。多种神经内分泌肽，如SP、VIP均能与其受体结合，活化肥大细胞，引起肥大细胞的脱颗粒及组胺的释放。艾灸引发局部的神经源性炎症，对皮肤神经肽、肥大细胞以及与瞬时感受器电位（TRP）家族的影响，可能是艾灸以温促通作用机制的生物学基础，值得进一步深入研究。

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Effects of Mild Moxibustion on the Local Morphology of HouSanLi Points and the Expressions of CGRP，SP and VIP in Rats

LI Mei，WANG Yaoshuai△，WANG Yingyue
The Second Clinical School of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

Objective：To study the warming effects of the mild moxibustion on HouSanLi points of the rats and its biological basis.Methods：HouSanLi points of the hyperlipidemia rat models were observed.HE staining and immunohistochemical methods were adopted to observe the local skin morphological structure of HouSanLi points，expression changes of calcitonin gene-related peptide（CGRP），substance P（SP）and vasoactive intestinal polypeptide（VIP）in skin tissues under the stimulating of the mild moxibustion.Results：when mild moxibustion group was compared with the control group，local skin morphological structure of HouSanLi points changed obviously，cutinized layer became thin or disappeared，the epidermis layer was not complete and dermis collagen fibers were in loose arrangement；the expression of CGRP in acupoint local skin appeared in dermal connective tissue more after the moxibustion，SP more expressed in hair follicles and VIP expression in the dermis of connective tissue and epidermis.Conclusions：Heat stimulating of the mild moxibustion can change the local morphological structure of Hou－SanLi points and affect the expressions of CGRP，SP and VIP in the local skin of HouSanLi points.And the effects above may be related to the biological basis of the warming effect of moxibustion.

mild moxibustion；HouSanLi；CGRP；SP；VIP

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0007-03

2015-12-23

南京中医药大学自然科学基金预研项目（编号13XYYZ6）。

李梅（1987—），女，硕士学位。研究方向：针灸治疗神经内分泌疾病的效应研究。

△王耀帅（1983—），男，博士学位，讲师。研究方向：针灸治疗神经内分泌疾病的效应研究。