Nafion修饰碳纤维微电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺素

李　梅，陈　慧，伍雪巍，农燕婷，陈思伶，唐旻奕，程　寒

(中南民族大学　药学院，湖北　武汉　430074)



Nafion修饰碳纤维微电极在抗坏血酸共存下选择性测定去甲肾上腺素

李梅，陈慧，伍雪巍，农燕婷，陈思伶，唐旻奕，程寒*

(中南民族大学药学院，湖北武汉430074)

制备了碳纤维微电极，将洁净的碳纤维微电极浸入Nafion溶液中，采用电沉积的方法制得Nafion修饰碳纤维微电极。采用循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)研究了去甲肾上腺素(NE)和抗坏血酸(AA)在电极上的电化学行为。结果表明：在最优条件下制备的Nafion修饰电极能完全屏蔽AA的电化学响应，而对NE仍表现出良好的电化学响应。修饰电极能在1.0 mmol/L AA的共存下选择性地测定NE，采用DPV进行检测，NE的氧化峰电流与其浓度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.991 2，检出限(S/N=3)为8.6×10-7mol/L。利用该方法测定了模拟样品中NE的含量，平均加标回收率为101.6%。该电极的重现性和稳定性良好，且具有良好的灵敏度和选择性，有望用于复杂生物环境中NE浓度的检测。

Nafion；碳纤维电极；差分脉冲伏安法；循环伏安法；去甲肾上腺素；抗坏血酸

去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌。动物体内的NE含量变化反映了肢体神经系统植物交感神经的活动状况，其代谢障碍会引起含量的改变，从而影响心血管功能的调节、镇痛、情感障碍、体温调节、摄食等生理功能，因此在临床和基础研究中具有非常重要的作用[1-4]。抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)又称维生素C，是一种在生物体内维持机体正常生理功能的维生素，作为一种抗氧化剂，AA还可以保护身体免受自由基的威胁。NE与AA均为电化学活性物质，可采用电化学方法进行检测。由于在哺乳动物体内AA与NE共存，但AA平均浓度比NE高10～1 000倍，且与NE氧化峰重叠，从而干扰NE的测定[5-6]。因此排除AA的干扰，选择性测定NE在生理功能研究和临床检测中有重要意义。张宏等[7]利用电沉积的方法制得纳米金修饰玻碳电极，该修饰电极对NE氧化反应有催化作用。由NE和AA在纳米金修饰电极上的循环伏安图可观察到两个明显分开的氧化峰，峰电位差达131 mV，因此，可利用该修饰电极在AA存在下选择性测定NE。但因纳米金修饰层易脱落，导致修饰电极不稳定。

Nafion聚合物因具有导电性好、对热和化学物质稳定、阻抗小、水中溶解度小，同时还具有化学惰性、耐腐蚀性等优点，成为一种良好的电极修饰材料[8-11]。由于Nafion膜含有带负电的磺酸基团，只与阳离子发生选择性交换，排斥中性分子和阴离子，是一种优良的阳离子交换剂[12-14]，因此用作电极修饰材料具有良好的离子选择性。Nafion膜广泛应用于化学修饰电极以增加修饰电极对阳离子的选择性[15-17]。金利通等[8]的研究显示，Nafion膜修饰电极对表面活性物质具有良好的抗干扰能力，因此应用Nafion修饰电极可提高分析灵敏度和抗干扰能力。

本文利用两种方法制备了Nafion修饰碳纤维电极，对两种方法的修饰效果进行比较，选择较优的电沉积法将Nafion修饰到碳纤维电极表面，对电沉积时间进行了优化，并进一步探索了AA和NE在修饰电极上的电化学行为。实验结果表明，修饰电极对NE有良好的电化学响应及稳定性，且能完全屏蔽AA的电化学信号，采用该修饰方法可在高浓度AA共存下选择性地测定NE。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

XD-RFL实验室倒置显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)，CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)，采用两电极系统，碳纤维微电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极。分析天平(奥豪斯上海责任有限公司)，FE20K型酸度计(瑞士梅特勒-托利多集团)。

碳纤维(直径6 μm，吉林市神舟碳纤维有限责任公司)；5% Nafion(Sigma公司)；去甲肾上腺素(NE，Sigma公司)用0.1 mol/L的HClO4配成1.0×10-2mol/L的母液，置于4 ℃的冰箱冷藏室中保存，使用时以Tris-HCl缓冲溶液稀释至所需浓度；碳粉导电胶(自制)，无水乙醇(分析纯，天津医药公司)，抗坏血酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，所有其它试剂均为国产分析纯，实验用水为二次去离子水。

1.2碳纤维微电极的制作

在酒精灯的外焰上拉制玻璃毛细管(内径1 mm)，使拉制好的毛细管尖端内径约20 μm，将分离好的碳纤维(直径6 μm，长约15 mm)和铜丝(铜丝两端均去掉约1.5 cm的绝缘层，铜丝直径0.2 mm，长约10 cm)用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外约2 mm，用AB胶将玻璃毛细管末端封住，且保证粘胶固化后固定在铜丝上，然后于酒精灯外焰上灼烧，迅速取出，直至玻璃毛细管尖端熔封，封好后，在倒置显微镜下测量电极长度，若碳纤维过长，则将露出的碳纤维在酒精灯外焰上烧蚀，确保露出的碳纤维长度为100～200 μm，即得碳纤维微电极。

1.3电沉积法制作Nafion修饰电极

用无水乙醇将5% Nafion试剂稀释至1%后使用。将裸电极置于制备好的1%Nafion溶液中，1.5 V电压下电镀5 s，取出，室温条件下自然晾干(3～5 min)，重复沉积多次，优化Nafion修饰量，修饰电极洗净待用。

1.4滴涂法制作Nafion修饰电极

将裸电极放在载玻片上，取制备好的1% Nafion溶液10 μL(Nafion溶液刚好能将碳纤维电极尖端浸没)，滴在电极尖端，室温下自然晾干，修饰电极洗净待用。

2　结果与讨论

2.1电沉积法与滴涂法修饰电极的稳定性比较

选择经电沉积5 s修饰的电极以及滴涂法制备的电极分别在1.0×10-4mol/L NE溶液中进行连续测定(DPV，n=5)。实验结果表明，采用电沉积法修饰的碳纤维电极在NE中多次测定，响应电流几乎不变，电极的重现性良好；而滴涂法修饰的电极多次测量后电流明显减弱。因此，采用电沉积法制备Nafion膜更稳定，碳纤维修饰电极的电化学性能亦更稳定。本实验选择电沉积法制备Nafion膜。

2.2Nafion修饰量的优化

将洁净碳纤维电极置于1% Nafion溶液中，于1.5 V电压下采用电流～时间曲线电沉积5 s，取出，室温下放置3～5 min，自然晾干，重复电沉积多次，每次电沉积完毕，均于1.0×10-3mol/L AA中记录DPV图。结果显示，由于Nafion 膜只与阳离子发生选择性交换，静电排斥阴离子，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)缓冲溶液中，AA带负电荷，因此，随着电沉积次数的增加，修饰电极于1.0×10-3mol/L AA溶液中的电化学响应逐渐减小，经1% Nafion溶液反复电沉积9次(5 s/次)后，修饰电极完全屏蔽了AA的电化学响应。

2.3Nafion修饰电极的扫描电镜表征

碳纤维微电极和Nafion修饰的碳纤维微电极的扫描电镜图片如图1所示，碳纤维微电极的表面平整光滑(图1A)，而修饰电极几何尺寸增加(图1B)，表明带负电荷的Nafion膜沉积在电极表面。

2.4Nafion修饰电极的伏安特性

采用1% Nafion溶液反复电沉积9次(5 s/次)得到Nafion修饰的碳纤维电极，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)缓冲溶液中，考察了电极修饰前后在1.0×10-3mol/L AA和1.0×10-4mol/L NE溶液中的差分脉冲伏安曲线。由图可见，修饰Nafion前，电极在AA溶液中有较强电流信号，修饰后电极在1.0×10-3mol/L AA中几乎无响应，AA的电化学信号完全被屏蔽(图2A)；在1.0×10-4mol/L NE中Nafion修饰电极比裸电极的响应电流略小，但仍表现出良好的电化学响应(图2B)。

由此可见，采用最优条件下的Nafion修饰电极能完全屏蔽AA的电化学响应，而对NE仍表现出良好的电化学响应。这是因为在pH 7.2的Tris-HCl中，由于Nafion结构中含有磺酸基，在溶液中解离后可使修饰的电极表面带负电荷。NE结构中含有两个酚羟基和一个氨基，碱性较强，在pH 7.2的条件下，以质子化形式存在，带正电荷；而AA在此体系中带负电荷。由于异性电荷相吸引，NE吸附在电极表面，使得其在电极表面的浓度增加，同时Nafion修饰层的存在也在一定程度上减弱了电极的电子传递能力，在上述两种作用的影响下，NE的氧化峰电流略有减小，但仍表现出良好的电化学响应。

2.5NE氧化峰电流与扫速的关系

研究了洁净碳纤维电极在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰电流(I，μA)与扫描速率(v,mV/s)之间的关系。结果显示，在20～2 000 mV/s扫速范围内，NE的氧化峰电流随着扫速的增大而增大，且氧化峰电流与扫速成正比，线性回归方程为I=7×10-12v+2×10-8，r=0.995 0，表明NE在碳纤维电极上的氧化过程受吸附控制。

同时，研究了Nafion修饰电极在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰电流与扫描速率之间的关系，结果显示，在20～2 000 mV/s扫速范围内，NE的氧化峰电流与扫速成正比，回归方程为I=6×10-12v+1×10-8，r=0.999 0，表明NE在修饰电极上的氧化过程亦受吸附控制。

2.6工作曲线及线性范围

在1.0×10-3mol/L AA共存条件下，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)缓冲溶液中，利用DPV法测定NE，结果见图3。在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内，NE的氧化峰电流随其浓度的增大而增大，且NE的浓度与氧化峰电流呈良好的线性关系(图3插图)，其线性方程为I=3×10-5c+4×10-10,r2=0.991 2。修饰电极对Nafion的检出限(S/N=3)达8.6×10-7mol/L。即使在AA浓度高出NE 3个数量级的情况下，Nafion修饰电极仍能选择性地检测NE。

2.7实际样品的测定

在优化条件下，采用20 mmol/L Tris-HCl配制3.0×10-5mol/L NE及1.0×10-3mol/L AA混合溶液，在优化条件下对电极进行电沉积修饰，并对NE做3个水平(4.0×10-5，3.0×10-5，5.0×10-5mol/L)的加标回收率实验，测得回收率分别为101.1%，101.7%，102.0%，平均回收率为101.6%。

3　结　论

本文采用电沉积法及滴涂法将Nafion修饰到碳纤维电极表面，形成Nafion修饰的碳纤维电极，实验结果表明电沉积法制备的修饰电极电化学性能更稳定。研究了NE和AA在该修饰电极上的电化学行为，优化了Nafion的修饰用量，使得修饰电极能屏蔽AA的电化学响应。Nafion修饰电极能在高浓度(1.0×10-3mol/L)AA共存下选择性测定NE，且NE的氧化峰电流与浓度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系。该修饰方法具有良好的灵敏度和选择性，有望用于复杂生物环境中NE浓度的检测。

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Selective Detection of Norepinephrine at Nafion Modified Carbon Fiber Microelectrode in the Presence of Ascorbic Acid

LI Mei,CHEN Hui,WU Xue-wei,NONG Yan-ting,CHEN Si-ling,TANG Min-yi,CHENG Han*

(College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan430074，China)

A carbon fiber microelectrode modified with Nafion was fabricated by electrodeposition method on the basis of previous work.The electrochemical behaviour of norepinephrine(NE) and ascorbic acid(AA) at the prepared microelectrodes before and after modification were investigated using cyclic voltammetry(CV) and differential pulse votammetric(DPV) methods.Under the optimum conditions,the Nafion modified electrode can completely shield the electrochemical response of AA,however,a sensitive response to NE was obtained on the modified electrode.Based on this,the modified electrode can be used to selectively detect NE without interference from high concentration AA.DPV response of NE showed a good linearity(r2=0.991 2) at the modified microelectrode with its concentration in the range of 1.0×10-6-1.0×10-4mol/L,with a detection limit(S/N=3) of 8.6×10-7mol/L.The proposed method was applied in the determination of NE in simulation sample with spiked recovery of 101.6%.The modified electrode exhibited almost the same electrochemical behavior after a month,indicating that the modified electrode is pretty stable and has a good reproducibility.The advantages of excellent sensitivity and selectivity made the modified electrode could be used to monitor NE in complex biological environment.

Nafion；carbon fiber electrode；differential pulse voltammetry(DPV)；cyclic voltammetry(CV)；norepinephrine(NE)；ascorbic acid(AA)

2015-10-01；

2015-12-21

国家自然科学基金项目(21205144)；中南民族大学学术团队(XTZ15013)；中南民族大学民族药学十二五实验教学示范中心资助

程寒，博士，副教授，研究方向：药物分析，Tel:027-67841196，E-mail:chenghan@mail.scuec.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.020

O657.1;R458.3

A

1004-4957(2016)06-0744-05