聚硫堇为探针与固定化载体的适配体传感器用于双酚A的检测研究

杨绍明，张小荣，郑　玥，丁素游，陈延胜

(华东交通大学　理学院，江西　南昌　330013)



聚硫堇为探针与固定化载体的适配体传感器用于双酚A的检测研究

杨绍明*，张小荣，郑玥，丁素游，陈延胜

(华东交通大学理学院，江西南昌330013)

研制了一种简单和灵敏地检测环境激素双酚A(BPA)的电化学适配体传感器。首先在玻碳电极(GCE)表面采用电沉积法沉积一层多孔纳米金(NP-Au)，再采用电聚合法将硫堇(TH)和适配体(APT)一步聚合到电极表面，以聚硫堇(PTH)作为电化学探针和APT的固定化载体，以牛血清白蛋白(BSA)抑制非特异性吸附，构筑GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA传感器。采用差分脉冲伏安法对该传感器的电化学性能进行探究，发现双酚A在10.0 fg/mL～1.0 ng/mL浓度范围内有较好的信号响应，检出限为5.3 fg/mL。以GCE/PTH+APT/BSA传感器作为对照，其对双酚A在10.0 fg/mL～1.0 ng/mL浓度范围内呈线性关系，检出限为9.0 fg/mL。结果表明多孔纳米金的引入可有效提高传感器的灵敏度。GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA传感器具有选择性高和检出限低等优点。

双酚A；适配体；传感器；多孔纳米金；聚硫堇

双酚A(BPA)作为一种典型的环境激素，是聚碳酸酯塑料、聚合物封装等材料的基本组分，被广泛用于婴儿奶瓶、水瓶、食品容器、聚氯乙烯拉伸膜和硬纸板等材料中。BPA通过食品、饮用水及空气等的污染对人类健康造成威胁，并且在自然环境中不易分解，易在生物体内蓄积，因此受到世界各地监管机构的关注。目前，BPA的检测手段有色谱法、分光光度法以及免疫分析法等[1-4]。但传统的检测方法存在诸多不足，比如试剂、设备成本昂贵和灵敏度低等。电化学传感方法具有成本低、检测快速和灵敏度高等特点，是一种潜在的高效分析手段[5-7]。

适配体(APT) 是能够从生物体外筛选得到的单链DNA或RNA，链段的结构和碱基对排序可以随意组合配对，其和待测物之间可进行一对一的特异性结合，且反应迅速、灵敏度高[8]。由于这些特殊的性质，适配体较传统抗体在分子识别方面具有更为广阔的应用前景，受到了众多研究人员的关注。适配体电化学传感器在BPA的分析检测方面也取得了一定的进展，如以纳米材料石墨烯/金纳米粒子、多孔纳米金为信号增敏材料，以溶液中的铁氰化钾、嵌入在适配体-互补DNA中的亚甲基蓝或BPA的直接氧化为检测信号可实现对BPA的检测[9-11]。但目前报道的适配体传感器检测BPA的方法存在电化学探针使用不便或稳定性不高，以及BPA的直接氧化导致易产生干扰等缺点。

多孔纳米金是一种兼具纳米材料和多孔材料优点的固体材料，具有高的导电率、良好的生物相容性、超大的比表面积、较均匀的纳米孔和高的孔隙率特征，在生物传感器中作为信号放大基材受到越来越多的关注[12]。硫堇(TH)是噻吩嗪类的杂环分子，具有平面共轭结构，使之与DNA链能够通过嵌插方式进行结合，而其单体能够通过电化学方式进行聚合，形成聚硫堇(PTH)。PTH具有很好的电化学可逆性、稳定性以及高效的电子传递能力，在生物传感器方面可充当检测分析物的电化学探针[13-15]。

本文以玻碳电极(GCE)为基质，采用电沉积法在电极表面沉积一层多孔纳米金，利用多孔纳米金的大比表面积及其良好的导电性来放大电化学信号。利用硫堇单体的电聚合反应在电极表面形成的PTH作为修饰电极的电化学探针，PTH在聚合过程中，带负电荷的适配体通过静电作用镶嵌在带正电荷的PTH的网格中，从而实现适配体的固定化，将双酚A的适配体负载到玻碳电极表面，再以BSA作为封闭剂。当待测液中有BPA存在时，其与适配体进行特异性结合，从而导致修饰电极的电化学信号减弱，利用电化学信号的变化实现对BPA的定量检测。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

双酚A适配体(5′-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′，生工生物工程(上海)有限公司)[11]；氯金酸(HAuCl4，上海试剂一厂)；牛血清蛋白(BSA,上海晶纯实业有限公司)；双酚A(BPA，国药集团化学试剂有限公司)；硫堇(TH，上海化学试剂公司)；实验用水为蒸馏水。

CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；JSM-6701F型扫描电子显微镜(日本电子(JEOL)公司)；三电极体系(铂电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，3 mm直径玻碳电极为工作电极)。

1.2溶液的配制

双酚A适配体和硫堇溶液以pH 6.8的PBS配成含0.10 mmol/L TH和1.0 μmol/L双酚A的溶液，置于 4 ℃冰箱中保存；BSA 以PBS( 0.2 mol/L,pH 6.8) 缓冲溶液配制成 1.0 mg/mL的溶液，贮存于 4 ℃冰箱内；各浓度的BPA溶液均以乙醇配制。

1.3修饰电极的制备

1.3.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修饰电极的制备将GCE按照文献[15]的方法进行预处理后，置于新配的0.08 mol/L的HAuCl4和 0.004 mol/L 的Pb(CH3COO)2溶液中，于-0.5 V 电位下进行恒电位沉积，沉积时间为 70 s，得GCE/NP-Au修饰电极[17]。将该电极置于含有 1.0 μmol/L BPA适配体和0.10 mmol/L硫堇(TH)的溶液中循环伏安法扫描20圈，得到 GCE/NP-Au/PTH+APT修饰电极。再将该电极置于1.0 mg/mL 的 BSA 中浸泡 40 min，制得 GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修饰电极。

1.3.2GCE/PTH+APT/BSA 修饰电极的制备参照“1.3.1”将预处理好的GCE电极置于含有 1.0 μmol/L BPA适配体的硫堇溶液中循环伏安法扫描 20 圈，得到 GCE/PTH+APT 修饰电极。再将该电极置于1.0 mg/mL 的 BSA 中浸泡 40 min，制得 GCE/PTH+APT/BSA 修饰电极。

1.4电化学测试方法

将制备好的GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 或GCE/PTH+APT/BSA 电极置于0.2 mol/L PBS(pH 6.0)溶液中，使用三电极系统，采用差分脉冲伏安法(DPV)对GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 或GCE/PTH+APT/BSA 电极进行扫描得到空白电流(I0)，再将电极置于BPA溶液中培养40 min后，用DPV进行扫描得到电流I，以传感器的电流响应ΔI(ΔI=I-I0)实现对BPA的检测。

方位向间歇采样散射波是对传统散射波干扰的改进，其原理是：干扰机对截获到的SAR脉冲信号进行周期性地全脉冲采样(如图2)，然后转发至特定散射区域，干扰信号经散射后被SAR接收.忽略干扰机转发延时，设未经方位向间歇采样的传统散射波信号形式为

在含0.1 mol/L KCl的 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](体积比1∶1)溶液中测定得到交流阻抗谱(振幅:0.005 V，频率范围:1 ～ 100 000 Hz)，并通过ZSimpwin软件模拟而成。

2　结果与讨论

2.1多孔纳米金的表征

采用SEM对NP-Au/GCE的表面形貌进行表征。如图1A所示，采用电沉积法在玻碳电极表面沉积 70 s,得到纳米多孔金修饰电极，其表面的树枝状骨架之间形成多孔金结构，且排列致密，这与文献报道一致[18]。对NP-Au/GCE修饰电极进行能谱分析(图1B)，从图中可以明显看出碳元素和金元素的峰，出现碳元素是由于基底为玻碳电极，说明修饰在玻碳电极上的树枝网状多孔结构物质为多孔纳米金。

2.2不同修饰电极的 CV 表征

2.2.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA修饰电极采用CV法对该修饰电极的组装过程进行表征，结果见图2。图中曲线a为 GCE/NP-Au 修饰电极在 PBS 溶液中的循环伏安曲线，曲线b为电极表面负载适配体和聚硫堇后(GCE/NP-Au/PTH+APT修饰电极)的循环伏安曲线，在-0.1 V 左右出现1对聚硫堇的氧化还原峰；曲线c为GCE/NP-Au/PTH+APT修饰电极表面组装上BSA后的循环伏安曲线，由于BSA不导电，聚硫堇的氧化还原峰变小；曲线d为GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA在 10.0 pg/mL 的BPA中孵育 20 min 后的循环伏安曲线，聚硫堇的氧化还原峰电流继续减小，这是因为适配体与BPA结合到电极表面阻碍了聚硫堇氧化还原的电子传递，同时也说明BPA已成功结合到电极表面。

2.2.2GCE/PTH+APT/BSA 修饰电极采用CV法对该修饰电极的组装过程进行表征，结果见图3。图中曲线a为GCE在PBS溶液中的循环伏安曲线；曲线b为GCE电极表面负载适配体和电聚合一层硫堇后的循环伏安曲线，在-0.13 V 和-0.18 V 处出现的1对氧化还原峰为聚硫堇的氧化还原峰；曲线c为GCE/PTH+APT修饰电极表面组装上BSA后的循环伏安曲线，由于BSA不导电，聚硫堇的氧化还原峰变小；曲线d为GCE/PTH+APT/BSA在 10.0 pg/mL 的BPA中孵育 20 min 后的循环伏安曲线，聚硫堇的氧化还原峰电流继续减小，说明BPA已成功地结合到电极表面。比较图2～3可知，大比表面积和高导电性的NP-Au显著放大了电化学探针聚硫堇的信号。

2.3不同修饰电极的EIS表征

2.3.2GCE/PTH+APT/BSA 修饰电极采用EIS法对GCE/PTH+APT/BSA修饰电极的组装过程进行表征。结果显示，裸玻碳电极的阻抗图呈1个较小的半圆，其阻抗为64 Ω；在GCE电极表面负载上PTH+APT后，阻抗图的半圆直径增大，说明适配体的不导电性使阻抗增大(177 Ω)；分别在GCE/PTH+APT修饰电极表面组装上BSA及在10.0 pg/mL BPA中孵育后所测得的阻抗图，半圆直径持续增大(前者阻抗为192 Ω，后者为300 Ω)，说明BSA及BPA很好地组装到电极的表面。EIS表征结果表明，由于多孔纳米金的多孔性和良好导电性，在沉积多孔纳米金后的电极表面负载PTH+APT的阻抗(146 Ω)明显小于未沉积多孔纳米金修饰电极表面负载PTH+APT的阻抗(177 Ω)；而在10.0 pg/mL BPA中孵育后，GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的阻抗(390 Ω)明显比GCE/PTH+APT/BSA修饰电极的阻抗(300 Ω)大，说明多孔纳米金有效增大了电极的表面积及适配体的负载量，从而结合大量的BPA导致阻抗增大。

2.4修饰电极的性能研究

2.4.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修饰电极将修饰好的GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 电极置于不同浓度( 10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL)的BPA溶液中进行孵育，采用DPV法对其孵育后的电流变化ΔI进行测定。结果表明，BPA在 10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL 浓度范围内，ΔI与lgc呈线性关系，线性方程为ΔI=6.59lgc(pg/mL)-3.71，相关系数(r)为0.999，检出限(S/N=3)为 5.3 fg/mL。

2.4.2GCE/PTH+APT/BSA 修饰电极将修饰好的 GCE/PTH+APT/BSA 电极置于不同浓度(10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL)的BPA溶液中进行孵育，采用DPV法对其孵育后的电流变化进行测定。结果表明，BPA在 10.0 fg/mL～1.0 ng/mL 浓度范围内，ΔI与lgc呈线性关系，线性方程为ΔI=0.09 lgc(pg/mL)+0.03，相关系数(r)为0.999，检出限为9.0 fg/mL。

将两种修饰电极测定BPA的线性方程进行比较发现，由于多孔纳米金的引入，GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的灵敏度显著高于GCE/PTH+APT/BSA，表明多孔纳米金可有效增大电极的表面积从而增大适配体的负载量和聚硫堇的电化学信号，导致GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的灵敏度提高。

2.5抗干扰性与稳定性

为考察传感器的抗干扰能力，以乙醇分别配制10.0 pg/mL BPA、50.0 pg/mL苯酚以及100.0 pg/mL的邻苯二酚和间苯二酚进行干扰实验。结果显示，相对于该传感器对BPA的响应，其对5～10倍BPA浓度的苯酚、邻苯二酚及间苯二酚的响应较小，说明该传感器的抗干扰能力强。

对 GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修饰电极的稳定性进行测试。将其在10.0 pg/mL的BPA溶液中组装后采用DPV法测定10次，其对应峰电流值的相对标准偏差(RSD)为 5.6%；将此电化学核酸适配体吹干置于 4 ℃ 冰箱内1周后再测定，传感器的响应信号为初始的94%，说明该传感器的稳定性良好。同1支电极重复组装4次测定 10.0 pg/mL 的BPA，RSD为 2.0%；采用4支不同的金电极同时组装测定 10.0 pg/mL 的BPA，其RSD为 3.6%，说明该传感器的重现性良好。

2.6回收率实验

为考察GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修饰电极的实用性与可靠性，以随机配制的未知浓度样品对传感器进行3个浓度水平(0.010，1.0,10.0 ng/mL)的加标回收率实验。结果显示，3种加标水平的回收率分别为94.0%,106.0%和98.0%；RSD(n=3)分别为2.6%，4.8%和3.5%。

3　结　论

本文首先利用电沉积法在玻碳电极表面沉积一层多孔纳米金，再通过循环伏安法电聚合硫堇，将聚硫堇作为电化学探针，并以其作为固定化载体，在电聚合的过程中将BPA的适配体同步固定到电极表面，构筑以聚硫堇为电化学探针和固定化载体的适配体电化学生物传感器。采用DPV 法对该传感器的性能进行研究。结果表明，在GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA修饰电极上，BPA的ΔI与 其浓度的对数(lgc) 在 10.0 fg/mL～1.0 ng/mL 范围内呈线性关系，检出限为 5.3 fg/mL。同时对传感器的抗干扰性、稳定性和回收率进行了考察，结果表明，以聚硫堇为探针和固定化载体的核酸适配体电化学生物传感器对BPA具有良好的信号响应，且同时具有较高的选择性和灵敏度等优点。

[1]Mei Z L,Chu H Q,Chen W,Xue F,Liu J,Xu H N,Zhang R,Zheng L.Biosens.Bioelectron.,2013,39:26-30.[2]Ballesteros-Gomez A,Rubio S,Perez-Bendito D.J.Chromatogr.A,2009,1216(3):449-469.

[3]Ragavan K V,Rastogi N K,Thakur M S.TRACTrendsAnal.Chem.,2013,52:248-260.

[4]Huang Y,Chen L P,Chen G N.J.Instrum.Anal.(黄颖，陈亮平，陈国南.分析测试学报)，2015,34(4)：428-432.[5]Jo M,Ahn J Y,Lee J,Lee S,Hong S W,Yoo J W,Kang J K,Dua P,Lee D K,Hong S,Kim S.Oligonucleotides，2011,21(2):85-91.

[6]Ragavan K V,Selvakumar L S,Thakur M S.Chem.Commun.,2013,49:5960-5962.

[7]Kuang H,Yin H H,Liu L Q,Xu L G,Ma W,Xu C L.ACS.Appl.Mater.Int.,2014,6(1):364-369.

[8]Hianik T,Wang J.Electroanalysis,2009,21(11):1223-1235.

[9]Zhou L,Wang J P,Li D J,Li Y B.FoodChem.,2014,162:34-40.

[10]Zhu Y,Zhou C Q,Yan X P,Yan Y,Wang Q.Anal.Chim.Acta,2015,883:81-89.

[11]Xue F,Wu J J,Chu H Q,Mei Z L,Ye Y K,Liu J,Zhang R,Peng C F,Zheng L,Chen W.Microchim.Acta,2013,180(1/2):109-115.

[12]Wu C,Liu X Y,Li Y F,Du X Y,Wang X,Xu P.Biosens.Bioelectron.,2014,53:26-30.

[13]Feng H,Wang H,Zhang Y,Yan B N,Shen G L,Yu R Q.Anal.Sci.,2007,23:235-239.

[14]Zhang Y Z，Huang L.Microchim.Acta，2012,176(3/4):463-470.

[15]Baskar S,Chang J L,Zen J M.Biosens.Bioelectron.,2012,33(1):95-99.

[16]Yang S M,Li R Q,Li H,Chen Y S,Ding S Y.J.Instrum.Anal.(杨绍明，李瑞琴，李红，陈延胜，丁素游.分析测试学报),2015,34(4):395-400.

[17]Bonroy K,Friedt J M,Frederix F,Laureyn W,Langerock S,Campitelli A,Sara M,Borghs G,Goddeeris B,Declerck P.Anal.Chem.,2004,76(15):4299-4306.

[18]Lu L,Dong Y J,Wang J W,Li Q Q,Wu X.Anal.Methods，2015,7:6686-6694.

Study of Bisphenol A Determination Using Aptamer Sensor with Polythionine as Electrochemical Probe and Immobilization Matrix

YANG Shao-ming*,ZHANG Xiao-rong,ZHENG Yue,DING Su-you,CHEN Yan-sheng

(School of Sciences,East China Jiaotong University,Nanchang330013,China)

A simple and sensitive electrochemical aptamer sensor was developed for the determination of environmental hormone bisphenol A(BPA).Nanoporous Au(NP-Au) was first deposited on the glassy carbon electrode(GCE) surface by electrochemical deposition,followed by one-step electropolymerization synthesis of polythionine(PTH) and aptamer(APT).The PTH was used as a redox electrochemical probe and the immobilization matrix for APT.Then,BSA as a blocking agent was used to prevent non-specific adsorption.The electrochemical behavior of the GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA aptamer sensor was studied by DPV method.The GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA sensor showed a good linear range of 10.0 fg/mL-1.0 ng/mL for BPA with a detection limit of 5.3 fg/mL.The GCE/PTH+APT/BSA sensor as reference showed a linear range of 10.0 fg/mL-1.0 ng/mL for BPA with a detection limit of 9.0 fg/mL.The experimental results showed that the introduction of NP-Au could effectively improve the sensitivity.The GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA sensor had the advantages of high selectivity and low detection limit.

bisphenol A；aptamer；sensor；nanoporous Au；polythionine

2015-10-28；

2015-12-16

国家自然科学基金项目(21465012，21065004);江西省教育厅科技项目(GJJ150544)

杨绍明，博士，教授，研究方向：电分析化学及生物传感器，Tel：0791-87046336，E-mail：yangsm79@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.016

O657.1；O629.8

A

1004-4957(2016)06-0724-05