UPLC-MS法同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、甾体激素类及四环素类兽药残留

李　宁，张玉龙，林　涛，王继良，刘宏程*

(1.昆明医科大学　药学院，云南　昆明　650500；2.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南　昆明　650223)



UPLC-MS法同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、甾体激素类及四环素类兽药残留

李宁1,2，张玉龙1,2，林涛2，王继良1，刘宏程2*

(1.昆明医科大学药学院，云南昆明650500；2.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明650223)

建立并优化了同时测定牛奶中10种磺胺类、6种喹诺酮类、8种甾体激素类以及1种四环素类药物共25种兽药残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品中目标药物经5%乙酸乙腈提取，HLB固相萃取小柱净化后，通过UPLC-MS测定，外标法定量。25种兽药在不同加标浓度下的回收率为61.6%～119.2%，组内相对标准偏差(RSD)为2.5%～13.4%，组间RSD为5.8%～14.2%，方法检出限为0.5～2.0 μg/kg。

超高效液相色谱-串联质谱；牛奶；兽药残留；磺胺类；喹诺酮类；甾体激素类；四环素类

作为现代人们生活中不可或缺的食品之一，牛奶的营养价值得到了广泛认可和推崇。但部分生产者为了控制奶牛疾病，盲目而大量地使用各类兽药，长此以往造成细菌和病毒产生耐药性，导致只能增大剂量或同时使用多种药物，形成了恶性循环。还有一些生产者为了增加产量和提高生产效率，对奶牛使用各种甾体激素类药物，而该类药物的脂溶性较大，易分泌进入牛奶中，成为直接导致儿童性早熟及性发育异常的重要因素[1-2]。我国农业部235号公告仅对5种甾体激素类药物的残留限量做出了规定[3]，鉴于生产者用药的多样性及复杂性，建立一种能够同时快速测定多种兽药残留的分析检测方法势在必行。

目前国内牛奶中兽药残留的检测方法大多是针对抗菌抗病毒药物[4-9]，也有部分检测甾体激素类药物的报道[10-13]，但鲜有同时检测抗菌药物与甾体激素类药物的方法，尤其是本实验中3类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类)广泛使用的抗菌代表性药物与危害性日渐增长的甾体激素类药物同时检测的方法。

超高效液相色谱法因其分离效率高、柱效高、耗液少等优点受到了研究者的青睐[14]。本研究采用的Waters QDa质谱检测器可与色谱分析仪器完美兼容，且经过预先优化，可在稳定处理各种分析的同时降低意外共流出物或成分所带来的风险。该仪器方法将保留时间和质谱分析相结合，为化合物鉴定提供了更优的分析选择性，可在无需高端质谱仪的情况下提供分子信息和高质量定性质谱数据，采用SIR选择性检测模式可实现可靠的定量检测。通过质谱检测分析确认痕量成分，进而提升分析的质量和效率，实现完整快速的色谱分离及化合物鉴定，简化了实验室药品分析的工作流程。实验通过优化建立了一种能够同时快速测定多种抗菌药物及甾体激素类药物的分析检测方法，给日常分析检测工作提供借鉴的同时为国家制定食品安全限量标准及检测方法提供了参考。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Waters H-class超高效液相色谱仪、QDa质谱仪、BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色谱柱均购自美国Waters公司，电子天平(瑞士梅特勒公司)，涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器有限公司)，KQ-500DB超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，氮气吹干仪(美国Organomation Associates)。

乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制25种标准药物储备溶液:准确称取每种标准物质适量，用甲醇配成100 μg/mL的标准储备溶液，于4 ℃冰箱保存。

25种标准药物混合标准溶液:准确移取适量每种标准储备溶液混合，用甲醇配成10 μg/mL的标准储备溶液，于4 ℃冰箱保存。

Na2EDTA缓冲溶液:准确称取1.29 g柠檬酸、1.09 g磷酸氢二钠、3.72 g Na2EDTA-2H2O，加超纯水90 mL溶解，用氢氧化钠固体调至pH 6.0左右，定容至100 mL保存备用。

1.2.2样品前处理样品制备:购于超市的纯牛奶于4 ℃下保存备用。

提取:称取5 g牛奶试样于50 mL离心管中，加入5 mL Na2EDTA缓冲溶液(pH 6.0)，涡旋混匀1 min，45 ℃水浴超声3 min，加入10 mL 5%乙酸乙腈和2 g氯化钠、4 g无水Na2SO4，涡旋混匀1 min，超声提取5 min，5 000 r/min高速离心5 min，取上清液待净化。

净化:移取上清液于10 mL具刻度玻璃管中，40 ℃下氮气浓缩至近干，加入5 mL 缓冲液溶解稀释，待上样。HLB固相萃取小柱依次经6 mL甲醇、6 mL水、3 mL缓冲溶液活化，取稀释液上样，6 mL水淋洗，正压挤干或负压抽干小柱，8 mL甲醇-乙酸乙酯洗脱液(3∶7)洗脱，收集洗脱液，40 ℃下氮气浓缩吹干，1 mL甲醇定容，涡旋混匀1 min，过0.22 μm滤膜，待分析。

1.2.3超高效液相色谱-质谱条件超高效液相色谱条件:C18高效液相色谱柱(Waters BEH C181.7 μm×2.1 mm×50 mm)；载气为高纯氮气(≥99.999%)；流动相:A为甲醇，B为含10 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样体积1 μL；梯度洗脱步骤为:0～1 min，0～10%A；1～6 min，10%～60%A；6～7 min，60%～80%A；7～8 min，80%～10%A。

质谱条件:检测器:Waters QDa质谱仪；离子源:ESI源；扫描方式:正离子SIR扫描；扫描质量数范围为m/z30～500；采样速率8点/s；毛细管电压:0.8 kV；锥孔电压:15 V。

2　结果与讨论

2.1色谱及质谱条件的优化

本实验选用BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色谱柱分离目标化合物以达到有效分离的目的。由于磺胺类、喹诺酮类和四环素类药物均呈酸碱两性，流动相pH值对保留和分离的影响大。实验比较了甲醇-水和乙腈-水作流动相时的峰形和响应，以及甲酸、甲酸铵和乙酸铵的离子化效率，发现甲醇-0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L乙酸铵)作流动相时离子化效率高，峰形好，响应较高(见图1)。酸度过低会出现峰拖尾，过高则分离效果差。

本实验采用Waters QDa质谱检测器，操作简便，能够降低共流出物或基质本身的干扰，虽然灵敏度与三重四极杆质谱仪有一定的差距，但与紫外检测器相比，能够明显减少杂质峰，同时可在较短的时间内完成仪器的自检及调谐，快捷方便，基本能满足常规检测要求。

2.2提取条件的优化

目标化合物均易溶于丙酮、乙腈等非极性或中等极性溶剂，而乙腈具有较好的蛋白沉淀作用，有利于提取，因此选用乙腈作为提取溶剂，且以5%酸化乙腈对目标化合物的提取更优。当仅用酸化乙腈提取时发现喹诺酮类和四环素类药物基本未检出，这是由于喹诺酮类药物分子结构中的3-羧基和4-羰基可与Ca2+,Mg2+,Al3+,Zn2+等金属离子螯合，四环素类药物同样容易与金属离子螯合而影响提取效果，所以考虑加入EDTA缓冲溶液。一方面EDTA缓冲液可与基质中的金属离子螯合而使目标化合物分布到有机相中，且实验发现超声水浴30～40 ℃对EDTA和金属离子的螯合置换过程有一定帮助；另一方面，缓冲溶液起到了稀释基质的作用，一定程度上减小了基质效应的影响。同时，实验发现缓冲溶液的pH值对提取效果有很大影响，分别考察了pH 4.0，7.0，9.0时的提取效果。结果发现，由于磺胺、喹诺酮和四环素均属于两性化合物，因此过酸和过碱都不利于提取，而pH值对雌激素的影响则较小。此外，酸碱环境对3类化合物的影响大小也不同，其中酸性环境对于磺胺类药物和喹诺酮类药物的影响大于碱性环境，而四环素类药物则反之。在近中性条件下，目标化合物更易与金属离子形成不溶性络合物，因此最终选择pH 6.0的EDTA缓冲溶液进行后续考察。

2.3净化条件的优化

2.4线性范围与检出限

在最佳仪器条件下，配制不同浓度的标准工作液，以定量离子峰面积对其浓度进行线性回归分析，并绘制标准曲线。以牛奶空白基质进行检出限(LOD=3m1h0/(m0h1)，m1和h1分别表示加标量和化合物峰高；m0和h0分别表示牛奶基质量和基线高度)和定量下限(LOQ=3LOD)计算，结果如表1所示。25种目标药物在1～50 μg/kg浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99，LOD为0.5～2.0 μg/kg，LOQ为1.5～6.0 μg/kg。

表1　25种目标药物的线性范围、相关系数、检出限及定量下限

2.5回收率与精密度

以鲜牛奶和普通牛奶进行加标回收和精密度实验，分别以1LOQ,5LOQ和10LOQ作为加标水平，每个水平平行试验6次，结果如表2所示。25种目标药物的平均回收率为61.6%～119.2%，组内相对标准偏差(RSD)为2.5%～13.4%，组间RSD为5.8%～14.2%。鲜牛奶的回收率普遍低于普通纯牛奶，分析其原因可能与蛋白量、含钙量等基质成分有关，但基本满足日常分析对牛奶中目标药物的测定要求。

表2　25种兽类药物不同加标水平下的回收率及相对标准偏差

(续表2)

2.6实际样品的测定

随机抽取在售的鲜牛奶和纯牛奶各18份，采用本方法测定，在1份纯牛奶样品中检出磺胺间二甲氧嘧啶21.5 μg/kg，1份纯牛奶样品中检出磺胺甲基嘧啶10.6 μg/kg、恩诺沙星15.3 μg/kg，但均未超过我国农业部限量标准；1份鲜牛奶样品中检出孕酮4.5 μg/kg，我国农业部未对其作出限量规定，但未超过美国规定的5 μg/kg限量标准，其他样品未见检出。

3　结　论

本研究建立了牛奶中10种磺胺类、6种喹诺酮类、8种甾体激素类和1种四环素类共25种兽类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，优化了固相萃取法的样品前处理条件。该方法操作较简便，灵敏度高，可满足牛奶中25种兽类药物的痕量分析要求，尤其适于实验室外的分析检测。

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Analysis of Sulfonamide,Quinolones,Steroid Hormones and Tetracyclines Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LI Ning1,2，ZHANG Yu-long1,2，LIN Tao2，WANG Ji-liang1，LIU Hong-cheng2*

(1.School of Pharmaceutical Science,Kunming Medical University,Kunming650500,China；2.Institute of Agricultural Quality Standard & Testing Technique,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming650223,China)

A comprehensive method was developed and optimized for the simultaneous analysis of sulfonamides,quinolones,steroid hormones and tetracycline by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The veterinary drugs in milk samples were extracted with 5% acetic acid-acetonitrile solution,and then the mixture was centrifuged.The supernatant was purified with an HLB solid phase extraction column,and analysed by UPLC-MS and quantified by the external standard method.Average recoveries of 25 veterinary drugs at three spiked levels ranged from 61.6% to 119.2% with relative standard deviations(RSDs) of 2.5%-13.4%.The method limits of detection(LOD) for target compounds were in the range of 0.5-2.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS);milk;veterinary drugs residues；sulfonamides;quinolones；steroid hormones;tetracycline

2015-11-25；

2015-12-16

云南省科技惠民计划(2013RA012)；云南省科技创新平台建设计划(2014DA001)

刘宏程，博士，研究员，研究方向:农产品质量安全，Tel:0871-65160403，E-mail:liuorg@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.014

O657.63;O629.8

A

1004-4957(2016)06-0714-05