不同抗稻曲病水稻品种的RGA分析

唐善军，高杜娟，陈友德，李友荣，薛 丹，陈新华

不同抗稻曲病水稻品种的RGA分析

唐善军1，高杜娟1，陈友德1，李友荣1，薛 丹1，陈新华2

（1.湖南省水稻研究所，湖南 长沙 410125；2.安仁县农业科学研究所，湖南 安仁 423600）

利用抗病基因同源序列的原理对34份水稻品系进行遗传多样性分析。结果表明：引物XLRR for/XLRR rev和Pto-kin1/Pto-kin2扩增的RGA序列具有丰富的多态性。供试材料的抗性鉴定表明，34份参试材料对稻曲病的抗性表现出明显差异，病穗率范围为0%～35.4%，抗性从抗到高感。聚类分析结果表明，在遗传相似系数为0.73时，34个水稻品种可分为5类，但与水稻材料的抗感水平没有明显的对应关系。

抗病基因同源序列；稻曲病；抗性；遗传多样性

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.07.001

稻曲病是由绿核菌属稻绿核菌［Ustilaginoidea virens（Cooke.）Takah］引起的真菌病害，为害水稻穗部，严重影响水稻产量和品质，而且随着大穗型杂交水稻的大面积推广，稻曲病的发生正日趋严重。因此，发掘抗稻曲病种质、选育抗病品种是当前水稻安全生产亟待解决的问题。由于稻曲病菌生活史复杂以及人工接种方法的可重复性差，因此目前为止，该病的侵染循环、发病规律及其与寄主的互作方面都不完全清楚，这也导致现有的有关稻曲病的抗性评价方法受环境条件的影响较大。

以抗病基因的保守序列设计引物，应用PCR技术，扩增抗性基因同源序列（Resistance gene analogue，RGA），是一条快速鉴定候选抗病基因和评价抗病种质资源的途径。稻种资源的白叶枯病抗性可以通过RGA分析将抗病品种和感病品种明显区分开来，姬广海等［1］研究用2对RGA引物区分了云南抗白叶枯病稻种，Zhao等［2］发现RGA片段与野生稻抗白叶枯病基因连锁，Chen等［3］利用RGA标记发现多个与抗白叶枯病连锁的候选基因。但研究发现，RGA标记对区分稻种资源的稻瘟病抗性并不明确。例如：孙雁等［4］和陈于敏等［5］发现按RGA标记划分的类群与抗瘟性基本一致；但任鄄胜等［6］和刘二明等［7］用抗瘟性和RGA标记进行聚类，发现类与类之间没有明显的抗性对应关系。这可能与标记选择和所选稻种群体有关。研究利用抗性基因同源序列分析研究不同抗性品种中抗稻曲病相关的基因片段及其多态性，探索抗性基因同源序列和抗性表型之间的相关性，以期为稻种资源的稻曲病抗性鉴定提供分子水平依据，以期为稻曲病抗性鉴定和抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 水稻材料及稻曲病抗性鉴定

参试的34个水稻品系是经过多年鉴定抗性稳定的材料，均为籼稻类型。试验安排在农业部安仁有害生物防治重点野外科学观测试验站（湖南省水稻研究所安仁基地）进行。试验所用稻曲病圃于2009年建立，常年发病较重，积累了大量菌源。病圃内比普通水稻生产偏施氮肥，其他肥水管理同大田生产，全生育期内不施杀菌剂，具体病圃管理和栽培方式参见李友荣等［8］的方法。根据供试材料的抽穗期，安排两次喷雾分生孢子和菌丝混合液，供试的稻曲病菌菌株为当地分离的优势菌。

1.2 抗性评价标准

参考农业部行业（农业）科技专项“稻曲病控制技术的研究”项目组按病穗率进行品种抗性评价的方法［9］，制定了稻曲病抗性分级标准，见表1。

表1　水稻稻曲病抗性分级标准

1.3 DNA提取

取20粒饱满的水稻种子置于垫有滤纸的发芽盒中，发芽盒的长、宽、高分别是12 cm×12 cm×5 cm，在盒内加入适量的蒸馏水，盖上发芽盒盖，置于28 ℃的人工气候箱催芽，在第7天取种子的根和芽提取DNA，浓度大于100 ng/μL。水稻基因组提取方法按Zheng等［10］方法稍作修改进行。

1.4 供试引物

共选择5对引物从水稻总DNA中扩增抗病基因同源序列，序列信息见表2。

表2　抗病基因同源序列引物

1.5 PCR扩增、电泳和银染

水稻基因组DNA，反应体系中模板浓度10 μg/ mL。PCR反应体系：2×PCR Master（含染料）12.5 μL，模板0.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，无菌水补足25 μL。PCR反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增效果，采用2‰～3‰硝酸银染色。

1.6 聚类分析

以“1”和“0”分别表示抗病基因同源序列扩增片段的有和无，使用NTSYS软件中的非加权成对分组平均法程序进行聚类分析，构建RGA差异相似性树型图。

2 结果与分析

2.1 供试水稻的稻曲病抗性表型

前期对水稻稻曲病不同病情指标间关系研究表明，对大量水稻品种或资源进行抗性评价时，以病穗率作为调查指标，可真实准确反映其抗性水平［11］。

通过连续两年自然诱发辅助人工接种，以发病更重结果确定抗性和病级，如表3所示：不同水稻品系对稻曲病表现不同抗性，病穗率范围为0%～35.4%，无免疫高抗品系，按病穗率分级标准可分为5类：抗病品系为C6、C10、C11、C12、C17和C18等6个；中抗的有C1、C13和C28；中感的有C2、C4、C7、C8、C21、C22、C27和C30等8个；感病的有C3、C5、C9、C14、C23、C26、C29、C31、C32和 C34 等10个；高感的有C15、C16、C19、C20、C24、C25和C33等7个。

表3　34个水稻品系的稻曲病抗性鉴定结果

2.2 不同抗稻曲病水平的水稻品系的遗传多态性

所用5对抗病基因同源序列引物扩增出多条谱带，其中XLRR-for/XLRR-rev和Pto-kin1/Pto-kin2的多态性谱带较丰富。根据扩增谱带越多，抗病基因同源序列越丰富，抗病可能性越高的原则，将这两对引物的结果置于一起进行聚类分析。

通过软件聚类分析，获得遗传相似树状图（图1）。从图1的聚类结果可以看出，当以遗传相似系数0.47来划分时，可以将这34个水稻品系划分为2个RGA类群。相似系数0.6时，可划分为3个类群，C4单独成为一群。相似系数0.73时，可划分为5个类群。

2.3 水稻抗稻曲病表型与抗性基因同源序列相似性关系

图1　供试品系 RGA指纹聚类图

参试的34个水稻材料按病穗率分类与RGA聚类，类与类之间没有对应关系。但按RGA分为两个类群时，抗稻曲病表型为抗病和中抗品系C1、C6、C10、C11、C12、C13、C17和C18可以聚为一类。按RGA分为5个类群时，高感的C16、C19、C20、C24、C25和C33可以聚为一类。研究所用的材料均为籼稻品种，在遗传上相似性较高，另一方面所选5 对RGA引物仅有2对多态性较高，但仍然可以在一定程度上将同样抗感表现的水稻聚类，说明利用抗病基因同源序列对水稻稻曲病抗性鉴定是可行的。

3 讨 论

目前，国内外对稻曲病抗病性遗传的研究相对较少，徐建龙等［12］利用近等基因系检测到2个与抗病性相关的QTL，李余生等［13］利用重组自交系群体检测到多个与抗病基因相关的QTL。造成抗病遗传方面研究较少的原因是多方面的，一是稻曲病的侵染循环不清楚，其初侵染源、侵染部位和侵染时期都存在争议；二是无高效稳定的接种稻曲病体系，目前普遍采用的病原菌菌丝-孢子混合液注射接种，虽然可以高度诱发病害，但温湿度等环境因子以及品种生育期的影响都会导致发病不稳定，无法准确判断品种抗性，而且注射接种由于病原菌毒性等问题会导致稻穗畸形和抽穗困难［14］；三是由于稻曲病分级标准不统一，致使无公认的抗病品种。因此，合理而准确的抗性评价标准是筛选抗病种质资源的重要基础，也是寻找和发现抗病基因、进行种质创新和抗病育种的先决条件。

研究中所用的水稻品系是经过多年病圃筛选和人工接种得到的抗性比较稳定的材料，期望通过抗病基因同源序列克隆的方法找到与稻曲病抗性基因相关的片段，为快速评价水稻品种稻曲病抗性提供分子水平的支撑，解决目前无稳定接种体系的难题。从研究结果来看，所选的5对引物都不能有效的将抗感品种区分开来，其中引物S1/AS3、S1-inv/AS3-inv和LM637/ LM638根据抗病基因NBS-LRR（核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白）保守区域设计，主要参与抗性表达，这是植物抗病基因中数量最多的一类，其“进化”程度很高，抗病性是目前被发现的唯一功能。XLRR-for/XLRR-rev根据LRR保守序列设计，主要参与蛋白质间的互作，Pto-kin1/Pto-kin2根据Pto基因编码蛋白激酶序列设计。研究发现根据以上这些不同类型的抗病基因同源序列都不能将水稻品种按不同稻曲病抗性区分开来，这与卢代华等［15］利用SSR标记进行遗传分析发现所用标记不能对品种稻曲病抗性进行有效划分的结果类似，说明水稻抗稻曲病抗性基因可能是一类与已克隆抗性基因结构和功能不同的基因。

抗病品种是防治稻曲病最经济安全有效的方式，发掘并利用抗病基因是其首要任务，下一步可尝试采用其他多种分子标记，以筛选出对稻曲病抗性鉴定和抗病育种更加适合的分子标记。

［1］ 姬广海，张世光，魏兰芳， 等.云南抗白叶枯病稻种的RGA初析［J］.作物学报，2004，30（10）：969-974.

［2］ Zhao B-Y， Zhang Q， Leng H. Identification and tagging a new rice bacterial blight resistance gene from Oryza rufipogon［J］. Phytopathology，2002， 92：450-510.

［3］ Chen H， Wang S， Zhang Q. New gene for bacterial blight resistance in rice located on chromosome 12 identified from Minghui 63， an elite restorer line［J］. Phytopathology， 2002，92： 750-754.

［4］ 孙 雁，王云月，何月秋，等.云南稻种抗病基因同源序列类似性分析［J］.中国农业科学，2002， 35（5）：502-507.

［5］ 陈于敏，范成明，杨 妍，等.水稻抗病基因同源序列与抗瘟性的关系［J］.中国水稻科学，2008，22（2）：183-189.

［6］ 任鄄胜，肖培村，陈 勇，等.水稻品种稻瘟病抗性和抗病基因同源序列多态性分析［J］.中国农业科学，2009，42（1）：1-9.

［7］ 刘二明，肖一龙，易有金，等.水稻品种抗瘟性表型与抗病基因同源序列相似性的关系［J］.中国水稻科学，2005，19（3）：209-216.

［8］ 李友荣，唐善军，高杜娟，等.籼型三系杂交水稻稻曲病抗性遗传研究［J］.植物遗传资源学报，2013，14（5）：784-787.

［9］ 钱可峰.水稻稻曲病抗性遗传分析及普遍率与严重度的关系研究［D］.四川农业大学.2012.

［10］ Zheng K L， Subudi P K， Domingo J. Rapid DNA isolation for marked-assisted selection in rice breeding［J］. Rice Genet Newsl，1995，12：255-258.

［11］ 唐善军，高杜娟，陈友德，等.水稻稻曲病不同病情指标间关系研究［J］.植物保护，2014，40（1）：154-156.

［12］ 徐建龙，薛庆中，罗利军，等.近等基因导入定位水稻稻曲病数量性状位点的研究初报［J］.浙江农业学报，2002，14（1）：14-19.

［13］ 李余生，朱 镇，张亚东，等.水稻稻曲病抗性的主基因+多基因混合模型分析［J］.作物学报，2008，34（10）：1728-1733.

［14］ 吕仕琼，刘 浩，赵江林，等.稻曲菌素研究进展［J］.中国农学通报，2010，26（14）：265-268.

［15］ 卢代华，王 剑，伏荣桃，等.水稻对稻曲病不同抗性品种遗传多样性SSR分析［J］.西南农业学报，2015，28（2）：457-464.

（责任编辑：肖 亮）

RGA Analysis of Rice Lines with Different Resistance to Ustilaginoidea virens

TANG Shan-jun1，GAO Du-juan1，CHEN You-de1，LI You-rong1，XUE Dan1，CHEN Xin-hua2
（1. Hunan Rice Research Institute， Changsha 410125， PRC； 2. Anren Agricultural Science Institute， Anren 424600， PRC）

Thirty-four rice lines’ genetic diversity was analyzed by using resistance gene analogue （RGA） principle. The results showed that abundant RGA polymorphism was observed by using primers XLRR for/XLRR rev and Pto-kin1/Pto-kin2. And there was significant different in the resistance to rice false smut among tested lines with the diseased panicle rate range of 0-35.4% and the resistance to rice false smut in the range of resistance to highly susceptibility. The clustering analysis result showed that thirty-four rice lines could be divided into 5 groups at the genetic similar coefficient 0.73， however their resistant levels couldn’t be distinguished from RGA analysis. Key words： RGA； rice false smut； resistance； genetic diversity

S511

A

1006-060X（2016）07-0001-03

2016-05-05

湖南省农业支撑计划项目（2015NK3046）；湖南省水稻品种区试项目（2010-2015）

唐善军（1986-），男，湖南东安县人，助理研究员，主要从事水稻病害和育种研究。