pColdTMTF载体原核表达FocA可溶性蛋白的研究

曾发姣，舒 燕，缪 东，胡新旭，曾 艳

pColdTMTF载体原核表达FocA可溶性蛋白的研究

曾发姣，舒 燕，缪 东，胡新旭，曾 艳

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

为了较好地表达和纯化尿道致病性大肠杆菌F1C菌毛主要亚单位FocA蛋白，研究以pColdTMTF为载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中原核表达F1C菌毛主要亚单位FocA，验证表达的蛋白是否为可溶性蛋白，并对focA基因表达的最佳条件进行了优化。结果表明：目的基因focA在pCold表达系统中于15℃下诱导24 h蛋白表达量最高，IPTG浓度在0.1～1.0 mmol/L范围内都能表达目的基因，且不同浓度对目的蛋白表达量无明显差异；表达出来的FocA蛋白为可溶性蛋白。

大肠杆菌；F1C菌毛；FocA；原核表达

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.07.004

菌毛能够介导细菌对特异性宿主细胞的粘附，这对细菌感染和定植具有重要意义［1］。尿道致病性大肠杆菌是引起人类泌尿器官感染的大肠杆菌的总称。尿道致病性大肠杆菌菌毛依其血凝特性可以分为3类：第一类是对人红细胞凝集具有甘露糖抗性，如P、M、S菌毛［2］；第二类是对豚鼠红细胞凝集具有甘露糖敏感性，如1型菌毛［3］；第三类菌毛不具有血凝特性，如F1C菌毛。虽然F1C菌毛不具有血凝特性，但它在尿道致病性大肠杆菌粘附过程中是有一定的作用的。Virkola等研究表明F1C菌毛能够特异性粘附人肾集合管和远端小管。已经发现参与形成F1C菌毛的foc基因簇包括6个基因：focA、focC、focD、focG、focH和focI。其中，focA编码主要菌毛亚单位，大小约为17 kD。F1C菌毛由大约1 000个主要结构亚单位—FocA蛋白聚合在细菌表面而成。

重组蛋白在大肠杆菌中的表达一般可以分为可溶性表达和非可溶性表达。根据重组蛋白表达场所不同，可溶性表达又包括细胞外可溶性表达和细胞内可溶性表达。非可溶性表达都是指的细胞内表达，表达产物为包涵体［4］。因目的外源基因在大肠杆菌中进行高效表达之后，虽然存在于细胞质中，但往往是以包涵体的形式存在，无糖基，没有生物活性［5-7］。虽然形成的包涵体可有效的避免表达产物被细菌蛋白酶所降解和表达的重组蛋白对细胞的毒性作用，但要对包涵体进行分离纯化，需要对包涵体进行变复性处理。且包涵体溶解、复性是个问题，而且复性后，其蛋白活性远远不如天然蛋白活性。针对在大肠杆菌中表达重组蛋白时容易遇到的问题，我们尝试运用高效冷冻表达载体pColdTMTF载体来解决这一问题。研究以pColdTMTF为载体，在大肠杆菌中原核表达F1C菌毛主要亚单位FocA，验证表达的蛋白是否为可溶性蛋白，并对focA基因表达的最佳条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和载体 工程菌Ecoli DH5α、BL21（DE3）均由湖南省微生物研究院保存。克隆载体pMD18-T Simple 载体购自大连宝生物工程有限公司。表达载体pET-22b（+）vector、pColdTMTF载体由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 TIANgel Midi Purification Kit（北京天根生物有限公司）；Expand High FidelityPLUS PCRSystem、dNTP（Roche公司）；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、溶菌酶、DL2 000、λHindⅢ DNA Marker（Takara公司）；标准低分子量蛋白（Fermentas公司）；十二烷基磺酸钠（SDS）、二巯基苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺（Sigma公司）；氨苄青霉素、IPTG、Triton X-100、N-四甲基乙二胺（TEMED）（上海生物工程公司）。其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.1.3 主要仪器 P×2 Thermal Cycler PCR仪（Thermo fisher scientific），台式离心机（Eppendorf），台式冷冻离心机（Beckman公司），SDS-PAGE电泳仪及转印装置（Bio-Red），分光光度计（Eppendorf）、数码凝胶成像分析系统JD-801（捷达公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参照已发表的E.coli的F1C菌毛主要亚单位基因focA基因序列，设计引物，上游引物，引入NdeI酶切位点，下游引物引入BamH I酶切位点。

Up-FocA：3'-CGCCATATGAAGTTAAAATTCAT CTCCATGGCTGTA-5'

Lo-FocA：3'-CAGGGATCCCTGGTACTGAACTT TAAAGGTG-5'

1.2.2 focA基因的扩增 （1）制备PCR模板DNA。用煮沸裂解法制备PCR模板。取1 mL 37℃过夜振摇细菌培养物离心，沉淀用灭菌超纯水洗一次，离心去上清，用200 μL灭菌超纯水悬浮沉淀，煮沸10 min，10 000 r/min离心2 min，取上清作为PCR模板。（2） PCR反应体系（25 μL）：模板2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL；上下游引物各0.5 μL；Expand High Fidelity Enzyme（3.5 U/μL）0.5 μL；10×PCR buffer（with Mg2+）2.5 μL；灭菌去离子水17.5 μL。（3）PCR反应程序。94℃ 4 min；94℃ 50 s；53℃ 50 s；72℃ 50 s，25个循环；72℃ 10 min，PCR产物4℃保存。取5 μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，溴乙淀染色后，紫外灯下观察并拍照。

1.2.3 pColdTMTF-focA重组表达质粒的构建和表达（1）PCR产物的纯化与重组质粒pMD18-T-focA的构建及重组质粒酶切鉴定。用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒对PCR产物进行纯化回收，参照说明书进行具体操作。将纯化的PCR产物与pMD18-Tsimple 用T4 DNA连接酶，16℃连接过夜，将连接产物转化到DH5α感受态中，用氨苄青霉素抗性平板和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆。从氨苄抗性LB平板上挑取假定阳性菌落，用碱裂解法提取质粒。取质粒进行单酶切和双酶切，根据是否出现与预计大小相符的目的片段来确定目的基因是否已插入到pMD18-T vector。（2）重组质粒pColdTMTF-focA的构建及重组质粒酶切鉴定。用NdeI和BamHI双酶切消化focA-pMD18-T，用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒回收FocA片段；载体pColdTMTF的NdeI和BamHI的双酶切产物，经苯酚/氯仿抽提纯化后，与focA片段在4℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。用氨苄青霉素抗性LB平板和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆。根据是否出现与预计大小相符的目的片段来确定目的基因是否已插入到pColdTMTF载体。（3）序列测定。取阳性重组菌穿刺半固体培养基，37℃过夜培养后，寄上海生物工程技术有限公司测序。

1.2.4 focA基因在pColdTMTF-focA载体中的原核表达 focA基因在大肠杆菌中的原核表达参照文献进行［8］：将提取的重组质粒focA-pColdTMTF转化到BL21 （DE3）感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB中37℃培养过夜。过夜培养物以1%的接种量于37℃扩大培养至OD600=0.4～0.5时，15℃静置30 min后，加入IPTG诱导，终浓度分别为0.1、0.4、0.7、1.0 mmoL/L，15℃诱导培养24 h。离心收集菌体，用灭菌超纯水洗涤沉淀后，超声波裂解，4℃12 000 r/min离心5 min，分别取上清和沉淀制样进行SDS-PAGE电泳，比较不同浓度IPTG诱导对focA基因表达的影响，SDS-PAGE参照文献进行［9］。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物电泳鉴定结果

PCR产物经1.5%琼脂糖电泳，结果如图1所示。利用设计的引物以菌株E.coli1613基因组DNA为模板成功地扩增出了特异性目的条带，其大小与预计的540 bp相一致。

图1　F1C菌毛focA基因的PCR扩增产物电泳图

2.2 重组质粒的酶切鉴定结果

focA-pMD18-T重组质粒用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切的产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，出现约2.7 kb和540 bp两个条带，初步证明此质粒为含有目的基因的重组质粒（图2）；pColdTMTF-FocA用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切的产物分别约为5.7 kb和540 bp（图3）

2.3 序列测定结果分析

测序结果显示，试验所克隆的focA序列与已登录NCBI的focA基因序列相一致，同时也进一步验证了该试验重组表达质粒构建的正确性。

图2　重组质粒focA-pMD18-T的酶切图谱

图3　重组质粒pColdTMTF-focA的酶切图谱

2.4 重组质粒表达产物分析

用重组质粒pColdTMTF-focA转化E.coli BL21 （DE3）感受态细胞，获得pCold-focA-BL21（DE3）重组菌；分别用0.1、0.4、0.7、1.0 mmol/L的IPTG诱导重组菌，发现不同浓度IPTG诱导，重组菌的蛋白表达量差别不大（图4）。

图4　SDS-PAGE电泳分析

IPTG诱导后取菌体裂解物进行SDS-PAGE分析，结果表明，经IPTG诱导的重组菌菌体裂解物比未经诱导的明显多出一条分子量约为66 kD的特异条带（标签TF为48 kD，见图4）。超声波裂解菌体，发现蛋白存在于上清当中，即FocA蛋白在pColdTMTF-focA重组质粒中表达后以可溶性融合蛋白的形式存在（见图5）。

图5　SDS-PAGE电泳分析

3 讨 论

外源基因在大肠杆菌中原核表达，表达的蛋白往往以不溶的无活性包涵体形式存在。包涵体形成的原因很多，一般是由于蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行正确的折叠，或二硫键不能正确的配对，从而导致蛋白的非特异性结合，目的蛋白却无法达到足够的溶解度等［10］。与可溶性蛋白相比，包涵体具虽然有不易破碎、抗酸碱、抗酶解、产量较大等特点［11］，但重组蛋白以包涵体形式表达，将丧失了其生物活性。因此，必须对包涵体进行复性，才能得到具有正确空间构象的蛋白，而体外复性蛋白质的效率较低，且复性后蛋白的活性远远不及天然蛋白。

为探寻focA基因表达的最佳条件，试验使用pCold表达系统表达FocA蛋白，通过对不同IPTG浓度诱导条件下重组菌蛋白表达进行SDS-PAGE分析，发现目的基因在pCold表达系统中于15℃下诱导24 h蛋白表达量最高，IPTG浓度在0.1～1.0 mmol/L范围内都能表达目的基因，其中IPTG诱导浓度在0.1、0.4、0.7 和1.0 mmol/L时，目的蛋白表达量无明显差异。超声波裂解诱导后的重组菌菌液，目的蛋白存在于上清中，说明该重组蛋白是以可溶性形式存在。之前利用pET表达系统在37℃条件下加IPTG诱导，不表达FocA蛋白；而focA-pET22b（+）重组质粒经30℃在0.1～1.0 mmol/L IPTG诱导范围内都能表达目的基因，但目的蛋白是以包涵体形式存在。

要使外源性蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，可以从宿主与载体的选择、不同的培养条件、诱导方法等方面来进行探索。pCold表达载体采用了CspA启动子，诱导温度在15～37℃之间，其中以15℃诱导效果最佳；在低温诱导条件下，其他细胞蛋白的表达受到抑制，细菌生长变得缓慢。这使得目的蛋白的表达量和纯度得到增加，可以达到细胞蛋白的 60%。与传统的大肠杆菌表达系统相比，其可溶性目的蛋白的表达量也大大增加。通过基因工程改造，目的蛋白在大肠杆菌中实现了可溶性表达，使得蛋白纯化将不再需要对包涵体进行变性、复性等操作，大大简化了表达程序和试验步骤，节省了试验时间，为目的蛋白的高效利用打下了基础。

［1］ Manfred O，Heinz H，Klaus J，et al. Gene clusters for S fimbrial adhesin（sfa） and F1C fimbriae（foc）of Escherichia coli: comparative aspects of structure and function［J］. Journal of Bacteriology，1988，170：3983-3990.

［2］ Vaisanen-Rhen V，Elo J，Vilsinen E，et al. P-fimbriated clones among uropathogenic Escherichia coli strains［J］. Immun，1984，43：149-155.

［3］ Nico R，Ron K，Hans V V，et al. F1C fimbriae of a uropathogenic Escherichia coli strain：genetic and functional organization of the foc gene cluster and identification of minor subunits［J］. Journal of Bacteriology，1990，172：1114-1120.

［4］ 王海林，高向阳. 包涵体纯化技术［J］. 生物技术通报，2007，（1）：78-79.

［5］ 翁伟平. GST-LRF融合蛋白纯化及单克隆抗体的制备［D］. 杨陵：西北农林科技大学，2008.

［6］ 张 喆，李 健，王 芸，等. 中国对虾细胞色素P450基因CYP4原核表达条件优化［J］. 海洋科学，2011，35（9）：49-55.

［7］ 王倩囡. 捻转血矛线虫H15 ES抗原基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立［D］. 哈尔滨：东北农业大学，2009.

［8］ 舒 燕. 金黄色葡萄球菌Fe摄取调节蛋白SirA的原核表达及其功能的初步研究［D］. 扬州：扬州大学，2011.

［9］ 刘俊斌. 987P菌毛蛋白FasG基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备［D］. 扬州：扬州大学，2006.

［10］ Palmer I，Wingfield P T. Preparation and extraction of insoluble（inclusion body）proteins from Escherichia coli［J］. Current Protocols In Protein Science，2004，16（4）：131-143.

［11］ 邝爱丽，陈圆圆，彭志峰，等. 包涵体的形成原因及处理方法［J］.上海畜牧兽医通讯，2009，（1）：62-63.

（责任编辑：成 平）

Prokaryotic Expression of Soluble FocA Protein with pColdTMTF Vector

ZENG Fa-jiao，SHU Yan， MIAO Dong，HU Xin-xu，ZENG Yan
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to express and purify F1C fimbriae mainly subunit FocA protein from uropathogenic Escherichia coli， this experiment expressed FocA protein in Escherichia coli BL21 （DE3） with pColdTMTF vector， verifiedits solublility， and optimized focA gene expression condition. The results showed that focA protein expression reached the highest in pCold expression system by IPTG induced for 24 h under 15℃， and there were no significant difference in expression under 0.1-1.0 mmol/L IPTG conditions. Moreover it was found that the target protein FocA-TF was soluble.

Escherichia coli； F1C fimbriae； FocA； prokaryotic expression

Q786

A

1006-060X（2016）07-0012-03

2016-04-22

湖南省自然科学基金资助项目（14JJ4070）

曾发姣（1980-），女，湖南茶陵县人，经济师，主要从事动物健康养殖、动物微生态制剂研究。

曾 艳