粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆与表达分析

代军飞，牛　锋，钟　琦，吴慧昊

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)



粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆与表达分析

代军飞1，2，牛锋2*，钟琦1，吴慧昊2

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)

以粘性丝孢酵母BG基因为研究对象，采用PCR方法克隆出BG基因的部分CDs区片段，并用RT-PCR方法分析了BG在不同培养条件下的表达量.实验结果如下：克隆扩增获得长为570 bp，编码189个氨基酸的部分CDs区片段.通过实时荧光定量PCR方法分析粘性丝孢酵母BG基因在不同pH、C/N、温度以及培养时间下的表达量.结果显示培养温度、pH、C/N对粘性丝孢酵母BG基因表达量无显著性影响.培养时间对其具有显著性影响，呈先上升后下降的趋势，在第3 d时表达量最高且极显著高于其他培养时期.此研究为进一步研究该基因的功能奠定了基础.

粘性丝孢酵母； β-葡萄糖苷酶；CDs克隆；表达分析

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)作为糖苷水解酶家族成员，属于纤维素水解酶系，主要参与水解位于末端非还原性，即糖基原子团同芳基或烷基间的β-D-糖苷键生成葡萄糖，如β-葡萄糖苷和β-半乳糖苷，对于木糖及果糖苷也具有一定作用.β-葡萄糖苷酶最初由Liebig和Wohler在苦杏仁中分离得到，1977年sternberg等人提出β-葡萄糖苷酶可减少纤维二糖抑制纤维素酶作用提高水解活性，随后对于β-葡萄糖苷酶的研究备受关注[1,2].许多研究表明，微生物的纤维素酶主要包括β-葡萄糖苷酶和内切-β-1，4-葡聚糖酶组成.由于不同来源的酶具有不同的性质，即使同一菌株也可分离纯化出多种不同性质的β-葡萄糖苷酶，其核苷酸同源关系也相对较远.2001年有人在Asperglllus tubingenis分离出四种不同分子量和等电点等性质的β-葡萄糖苷酶[3].水解纤维素产生的糖类能够被发酵丝孢酵母利用合成微生物油脂.本试验旨在通过研究β-葡萄糖苷酶为发酵丝孢酵母高效利用木质纤维素生产微生物油脂奠定一定的基础.

1　材料与方法

1.1材料与试剂

粘性丝孢酵母(EAM-AC16)为本实验室筛选、诱导得到的高产油酵母、克隆载体pMD19T克隆载体、E.coli DH5α感受态细胞、Taq酶与反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM II购自大连宝生物公司.

1.2方法

1.2.1总RNA提取

液氮研磨预处理粘性丝孢酵母，根据Trizol法提取酵母总RNA,反转录试剂盒反转录成cDNA.

1.2.2引物设计

在Genbank上搜索β-葡萄糖苷酶，筛选出6个与粘性丝孢酵母亲缘关系较近的物种.毛孢子菌属：KLT42641.1，新型隐球菌grubii H99：XP_012053297.1，新型隐球菌：AAW47222.2，加特隐球菌：KGB79281.1，红酵母菌：KPV74362.1，法夫酵母：CDZ96384.1的β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列，使用ClustalX对上述氨基酸进行比对.通过比对发现有5处区域序列相对保守.选用与粘性丝孢酵母亲缘关系较近的毛孢子菌属核苷酸序列同时参照酿酒酵母密码子偏好性设计引物(表1).PCR扩增出目的基因片段.

1.2.3qRT-PCR表达分析

在相对定量检测中，为比较不同样本mRNA之间的表达量差异，需要各个样本RNA浓度、质量、目的基因扩增效率相同，但样本的不同导致这些条件不可能相同，因此需要合适的内参基因来消除样本不同所造成的差异[4].本实验选用26S作为内参基因(参照王致鹏[5])，引物序列见表1.

表1引物序列

图1　cDNA为模板梯度PCR电泳

图2　粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区编码蛋白序列

2　实验结果

2.1β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆

通过反转录得到粘性丝孢酵母的cDNA.根据保守区设计引物PCR扩增得到糖苷水解酶基因部分序列，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 ，结果显示在550～600 bp处有一条清晰明亮的条带(图1)，符合预测PCR产物大小.测序结果与编码蛋白结果如图2，序列长570 bp，编码189个氨基酸.同NCBI上所下载其他物种β-葡萄糖苷酶利用Clustal X比对，克隆序列编码蛋白序列比对结果见图3.

图3　β-葡萄糖苷酶cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种β-葡萄糖苷酶氨基酸序列多重比对

注：gi|831333084|(毛孢子菌属)；gi|820655986|(测序结果氨基酸序列)； gi|953359472|(新生隐球菌neoformans JEC21)gi|799346173|(新生隐球菌grubii H99)；gi|686628345|(加特隐球菌R265)；gi|939612339|(红酵母菌WP1)；gi|820655985|(法夫酵母).

2.2不同培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达分析

运用实时荧光定量RT-PCR技术结合SPSS软件对发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在不同培养时间、培养温度、pH、碳氮比进行差异表达分析，由图4熔解曲线可知，内参及目标基因均只具有单一信号峰，说明内参与β-葡萄糖苷酶基因没有非特异性扩增与引物二聚体.

对不同培养时期1 d、3 d、3.5 d和4 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量分析，以培养3.5的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照，结果如图5所示.β-葡萄糖苷酶基因在四种不同培养时期均有表达，但表达量具有明显差异.在培养3 d时基因表达量最高，并显著高于其他时期.培养3.5 d基因表达量较第3 d时显著减少，但显著高于第1 d与第4 d，第4 d表达量最低.

不同培养温度下对培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量分析，以30 ℃下培养3 d的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照，结果如图5所示.培养温度为30 ℃时，基因表达量最高，其后依次为28 ℃、35 ℃、25 ℃.培养温度在20～30 ℃时，β-葡萄糖苷酶基因表达量随着温度的升高而增加，在超过30 ℃后，随温度的增加而减少.虽然基因的表达量发生变化，但无显著性差异.

不同碳氮比条件下，以26S为内参，碳氮比2︰1时基因表达量为内对照进行差异表达分析.结果显示，培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因表达C/N为10︰1时最大，碳氮比为2︰1时次之，碳氮比为0.5︰1时β-葡萄糖苷酶基因表达量最少.根据SPSS软件分析结果显示,不同碳氮比培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达量差异不显著.

在初始pH分别为5、5.5、6、6.5的种子培养基中，以26S作为内参基因，pH为6.5时培养3 d的β-葡萄糖苷酶基因表达量作为内对照.对不同pH下培养3 d的发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因进行表达量差异性分析.结果显示pH为5.5时，基因表达量最高.在pH为5与6时表达量与内对照组表达量相差不大.根据SPSS统计软件分析pH为5与5.5时，培养3 d的酵母菌基因表达量差异不显著.

图4　β-葡萄糖苷酶基因熔解曲线与扩增曲线

图5　不同培养时期、温度、碳氮比、pH下β-葡萄糖苷酶基因表达量

3　分析与讨论

3.1β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区克隆

目前,获得β-葡萄糖苷酶基因最有效的手段就是利用序列的筛选定位分析[6].2000年Dan等人纯化了黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因，测得N端氨基酸序列后设计简并引物克隆得到基因序列，现今黑曲霉的两个β-葡萄糖苷酶基因bgl1和bgl2序列已全部获得[7].然而,对于粘性丝孢酵母研究较少.目前仅有少数几个基因部分序列被克隆出来.本实验利用不同物种β-葡萄糖苷酶氨基酸序列保守区域，以及同属β-葡萄糖苷酶亲缘关系相对较近，结合毛孢子菌属β-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母密码子偏好性设计引物，首次克隆出粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因部分CDs区.经过BLASTX比对分析，发酵丝孢酵母β-葡萄糖苷酶基因序列与毛孢子菌属的β-葡萄糖苷酶基因相似度相对较高，同隐球菌属同源关系次之.研究表明同属β-葡萄糖苷酶基因在核苷酸来源、氨基酸序列和产物酶学性质等方面相似性均较高，但来自不同属的β-葡萄糖苷酶基因同源性极低[8，9].因此可以说明,克隆的目的基因为β-葡萄糖苷酶基因部分在CDs区.

3.2不同培养条件下β-葡萄糖苷酶基因表达分析

环境是影响基因表达的重要因素之一，即使同种微生物在不同环境中也表现出不同的理化性质.对酵母而言，培养时间、温度、碳氮比、pH是影响其生长的主要环境因素.本试验研究了不同pH、C/N、温度和培养时间对BG基因表达量的影响.结果显示pH、C/N、温度对其表达量影响不显著.与张玉芳[10]等人的研究结果相似，可作为研究粘性丝孢酵母在相同培养时期下相对定量的内参候选基因之一.余培铠[11]就曾以BG基因作为研究太瑞斯梭孢壳霉糖代谢相关基因表达的候选内参基因；在不同培养时期BG基因的表达量具有显著性差异.在培养前期基因表达量显著增大随后下降.隋飞飞[12]在研究桦褐孔菌葡萄糖苷酶时发现其表达量在菌核发育的不同时期表达量也呈此种趋势，本实验结果与其相似，说明BG基因表达量与酵母生长时期显著相关.

综上所述温度、pH、碳氮比、培养时间四个考察因素中，培养时间是影响基因β-葡萄糖苷酶基因表达量的关键因素.

4　结论

首次克隆粘性丝孢酵母BG基因部分CDs区长570 bp，编码189个氨基酸的序列，并对其不同培养条件下差异表达分析，结果显示pH、碳氮比、温度与培养时间四个考察因素中，培养时间是影响基因β-葡萄糖苷酶基因表达量的关键因素，为进一步研究粘性丝孢酵母β-葡萄糖苷酶奠定基础.

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【Abstract】秀BG(β-glucosidase) of Trichosporon mucoides was used as research subject., The partial CDs of 秀BG gene was cloned by polymerase chain reaction (PCR) from Trichosporon mucoides. 秀BG mRNA gene was examined in different culture conditions by RT-PCR. Results showed that the partial CDs of 秀BG gene was 570bp, which encoded 189 amino acids. 秀BG gene was analyzed in different pH, carbon and nitrogen ratio(C/N), temperature and time by RT-PCR. Temperature, pH and C/N had no significant effect on the expression of 秀BG gene in Trichosporon mucoides. whereas time was different from them. The expression level in 3d was significantly higher than that in other culture phase, and was decreased after increasing. This finding may provide basic data for further studying the role of β-glucosidase gene in Trichosporon mucoides.

Cloning and expression analysis of the partial CDs of β-glucosidase gene in Trichosporon mucoides

DAI Jun-fei1,2, NIU Feng2, ZHONG Qi1, WU Hui-hao2

(1.College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030;2.Science Experimental Center, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030)

Trichosporon mucoides; β-glucosidase;clone;expression

2016-02-20

降脂菌的筛选鉴定和开发利用(XBMU-2011-BC-40).

*

代军飞(1989—)，男(满族)，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事动物营养与微生物营养方面的研究

Q786；S828

A

1009-2102(2016)01-0033-05