HPLC法同时测定清心明目上清片中栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量

2016-08-25翟媛媛师永清

西北民族大学学报（自然科学版） 2016年1期

关键词：明目小檗连翘

翟媛媛，师永清

(西北民族大学化工学院，甘肃兰州 730124)

HPLC法同时测定清心明目上清片中栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量

翟媛媛，师永清*

(西北民族大学化工学院，甘肃兰州 730124)

目的：建立HPLC同时测定清心明目上清片中四种成分(栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱)含量的方法.方法：色谱柱.AglientTC-C18(4.6mm×250mm,5μm) ,流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱程序依次为.0～10 min 18%B，10～12 min 20%～30%B，12～14 min30%～16%B，14～20 min 16%～28%B，20～30 min 28%～65%B,30～40 min 65%～80%B，流速0.9 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长分别为238 nm(栀子苷和连翘苷)、275 nm(黄芩苷和盐酸小檗碱).结果：栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱分别在0.031 1～0.622 2 μg (r=0.999 6),0.533 3～8.000 μg(r=0.999 6),0.080 0～1.600 0 μg(r=0.999 5)，0.115 6～1.155 6 μg(r=0.999 4)范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为98.4%、98.3%、97.1%、98.2%.结论：本法操作简便、精密度高、重现性好，适用于同时测定清心明目上清片中栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量.

清心明目上清片；高效液相色谱；栀子苷；连翘苷；黄芩苷；盐酸小檗碱；含量测定

中成药的质量标准控制研究中很重要的研究内容是中成药多指标有效成分的含量测定，这种测定法可以全面控制药品质量和保障用药安全.清心明目上清片收载于部委颁布标准《中药成方制剂》，由黄连、黄芩、连翘、熟大黄、栀子、赤芍等21味中药组成[1].这种药具有清热散风，明目止痛作用，临床上用于焦火胜引起的暴发火眼，红肿痛痒，热泪昏花,云翳遮睛，头痛目眩，烦躁口渴,大便燥结等症[2～3].本文参照相关文献[3～7]，采用 HPLC 法同时测定清心明目上清片中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量.该方法简便、快速、准确，为其质量标准的研究提供了科学依据.

1　仪器与试剂

Agilennt1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，AB204-S型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，AS3120型双频数控超声破清洗仪(天津奥特赛斯恩斯仪器有限公司)，DFT-200型万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，Advanced-I-24L型艾柯实验室超纯水机(成都艾柯水处理有限公司).

栀子苷(批号：110749-200410)、黄芩苷(批号：110715-201016)、连翘苷(批号：110821-200305)、盐酸小檗碱(批号：110731-200609)，均购自中国药品生物制品检定所；乙腈(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；甲醇(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；磷酸(分析纯，烟台市双双化工有限公司)；清新明目上清片(太极集团四川绵阳制药有限公司；批号：12070005、12100008、55110003).水为超纯水，其他试剂均为分析纯.

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：AglientTC-C18, 流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱程序依次为：0～10 min 18%B，10～12 min 20%～30%B，12～14 min 30%～16%B，14～20 min 16%～28%B，20～30 min 28%～65%B,30～40 min 65%～80%B，流速0.9 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长分别为238 nm(栀子苷和连翘苷)、275 nm(黄芩苷和盐酸小檗碱).

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取减压至恒重的栀子苷、芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱的对照品适量分别置于5 mL容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀.制成栀子苷、黄芩苷、连翘苷、盐酸小檗碱浓度分别为0.14 g·L-1、0.2 g·L-1、0.36 g·L-1、1.04 g·L-1的对照品储备液.分别精密吸取上述对照品储备液1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、0.5 mL，混合均匀，即得含栀子苷、黄芩苷、连翘苷、盐酸小檗碱分别为0.0311 g·L-1、0.0533 g·L-1、0.1556 g·L-1、0.1156 g·L-1的对照品混合溶液，用0.45 nm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，备用.

2.2.2样品溶液的制备

取清心明目上清片5片，除去糖衣，置研钵中研细，取粉末约0.5 g，精密称定.置50 mL容量瓶中，加甲醇45 mL，超声提取1 h，放冷至室温，甲醇定容，静置10 min.取其上清液，用0.45 nm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，备用.

2.2.3阴性样品溶液的制备

图1　混合对照品(A)、样品(B)，阴性对照缺黄芩(C)，缺连翘(D)，缺盐酸小檗碱(E)，缺栀子(F)在238 nm处的色谱图

按清心明目上清片处方比例与制备工艺，分别制备栀子苷、黄芩苷、连翘苷、盐酸小檗碱阴性样品，按“2.2.2”下方法制备各阴性样品溶液.

2.3专属性检验

分别吸取对照品混合溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，按“2.1”下色谱条件进样，在238 nm 处检测，色谱图见图1.结果,样品溶液和对照品溶液色谱图上有一保留时间相同的特征峰, 保留时间分别为6.4、16.5、21.7、32.4，而阴性样品溶液在此保留时间无此特征峰，说明此方法专属性良好.拖尾因子分别为0.98、0.95、1.05、1.02.

2.4精密度试验

精密量取对照品混合溶液，按“2.1”下色谱条件，连续进样5 次，进样量为10 μL，记录色谱图.结果栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的RSD分别为0.5%、1.2%、0.7%、0.3%、0.6%，说明仪器精密度良好.

2.5线性关系考察

精密量取对照品混合溶液，按“2.1”下色谱条件，自动进样2、4、6、8、10 μL，记录峰面积.以对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的回归方程分别为:Y=1223.3X+12.429(r=0.999 6)，Y=202.06X-44.868(r=0.999 6)，Y=3005.3X-39.638(r=0.999 5)，Y=1880.2X+21.985(r=0.999 4).线性范围分别为0.031 1～0.622 2 μg，0.533 3～8.000 0 μg，0.080 0～1.600 0 μg，0.115 6～1.155 6 μg，线性关系良好.

2.6重复性检查

取同一批号(12100008)清新明目上清片样品6份，每份约0.5 g ，精密称定，按“2.2.2”下方法制备样品溶液，按“2.1”下色谱条件进样，进样量为10 μL，记录色谱图.结果栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量平均值分别为2.656、17.054、15.934、2.090.RSD分别为1.8%、1.7%、1.7%、1.8%，表明方法重复性良好.

2.7稳定性检查

取同一批号(12100008)样品的供试品溶液，室温放置，每隔2 h进样一次，共10 h，按“2.1”下色谱条件进样，进样量为10 μL，结果栀子苷、连翘苷、黄芩苷及盐酸小檗碱的RSD分别为1.5%、1.1%、1.5%、0.8%，说明样品溶液在10 h内基本稳定.

2.8加样回收率试验

表1清心明目上清片中栀子苷、连翘苷、黄芩苷及盐酸小檗碱含量测定(n=3)

精密称取同一批号样品( 批号12100008 ) 约0.5 g，按“2.2.2”下方法制备样品溶液，按“2.1”下色谱条件进样，进样量为10 μL.记录峰面积，得栀子苷、连翘苷、黄芩苷及盐酸小檗碱的回收率为98.4%、98.3%、97.1%、98.2%，RSD分别为1.1%、1.3%、1.5%、1.7%.

2.9样品含量测定

取3种不同批号的样品，每批各3份，按“2. 2. 2”下方法分别制备各样品溶液，按“2. 1”下色谱条件进样，进样量为10 μL，结果见表1.

3　讨论

3.1提取溶剂、提取方法及提取时间的选择

试验中，提取溶剂分别比较了过甲醇(50%)，甲醇(85%)、甲醇(65%)、纯甲醇，其中甲醇提取杂质峰较少，被测成分峰面积较大，因此选用甲醇作为提取.比较溶剂用量分别为30 mL、50 mL、100 mL，发现50 mL提取效果好，因此应将溶剂用量为50 mL.比较了超声提取时间为30、60、80 min，各被测成分提取量大致相同，因此选择超声提取30 min.

3.2流动相的选择

试验中以一定比例的甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-甲醇-水等作为流动相，均采用梯度洗脱程序，发现乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相时，各组分峰形较好，分离度高，基线较稳定，因此选择乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相.

3.3检测波长的选择

试验中根据二极管阵列检测器(PAD)得到的紫外吸收光谱图辅助成分定性和选择的各被测组分的检测波长，可知栀子苷和连翘苷在238 nm处有最大吸收.黄芩苷和盐酸小檗碱在275 nm处有最大吸收.故本试验采用双波长法，检测波长分别为238 nm(栀子苷和连翘苷)，275 nm(黄芩苷和盐酸小檗碱).

3.4小结

本文建立了HPLC同时测定清心明目上清片中栀子苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱含量的方法.该方法简便、结果准确、重复性好，且在各组分最大吸收波长处分别测定其含量，该方法显著提高了检测灵敏度，为其内在质量的控制提供了科学依据.

[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编眼科耳鼻喉科皮肤科分册[M]．北京：人民卫生出版社，2002.228.

[2] 杨全军,范明松,孙兆林,等.栀子化学成分、药理作用及体内过程研究进展[J].中国现代中药,2010,12(9):7-12.

[3] 王志超,杨小龙,张珂,等.栀子苷药理作用的研究进展[J].河南科技大学学报(医学版),2012,30(2):159-160.

[4] 师永清 ,师永花. 双波长RP-HPLC 法同时测定牛黄上清片中栀子苷和黄芩苷的含量[J].药物分析杂志,2011，31( 8):1586.

[5] 李发美,赵怀清,柴逸峰.分析化学[M].北京:人民卫生出版社,2011.

[6] 杜英峰,张兰桐,靳怡然,等.多波长RP-HPLC 法测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸和连翘苷[J]．中成药,2009,31(9) :1368.