基因芯片在痘病毒对宿主基因转录调控中的应用

陈达香，郝文波，陈　瑜，陈慧芹，罗树红



基因芯片在痘病毒对宿主基因转录调控中的应用

陈达香，郝文波，陈瑜，陈慧芹，罗树红

痘病毒(Poxvirus)是病毒颗粒最大的一类 DNA 病毒，结构复杂；感染人和动物后常引起局部或全身化脓性皮肤损害，给畜牧业带来严重的经济损失同时也威胁着人类健康。痘病毒可通过多种策略调控宿主基因的转录进而影响其免疫应答。基因芯片通过对宿主细胞在病毒感染前后基因表达谱的检测，为病毒的致病机制及病毒感染对宿主的调控机制的研究提供了便利手段。本文综述了有关基因芯片在痘病毒研究中的应用。

痘病毒；基因芯片；基因表达谱

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痘病毒呈砖形或椭圆形，大小(300～450)nm×(170～260)nm[1]；有核心、侧体和包膜，核心含有与蛋白结合的线型双链病毒DNA，其基因组长约为140 kb，在细胞质中复制。痘病毒脊索亚科中正痘病毒属 (Orthopoxvirus)和副痘病毒属(Parapoxvirus)为人类的重要病原体，其中正痘病毒属中天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒及猴痘病毒可引起人类疾病[2-3]，副痘病毒属的病毒主要感染家畜，羊口疮病毒感染人的病例也经常有报道[4-8]。

痘病毒凭借其庞大的基因组所表达的多种免疫调节蛋白，通过病毒隐形(virostealth)、病毒转导(virotransduction)以及病毒模拟(viromimicry)等多种不同的策略影响免疫细胞进而调控免疫系统[9]。痘苗病毒及其他种属的痘病毒在抗肿瘤、抗感染性疾病治疗中发挥不可忽视的作用，其相应的病毒制剂处于临床试验阶段，甚至有些已经进入临床应用，然而我们对于病毒对宿主细胞的作用机制却知之甚少。宿主细胞在病毒感染后往往是一个或几个功能基因群共同发挥作用，表达谱芯片为宿主细胞在某一特定时间点所有基因表达水平的监测提供了便利手段，使人们对与细胞在某个阶段的调控网络或对某刺激的反应通路的变化有了更深的了解。

1　基因芯片

基因芯片技术(gene chip technology)具有高通量、高集成、微型化和自动化等特点。自1995年Schena等[10]首次在《Nature》上发表基因芯片研究的论文以来其被广泛应用于临床检测和基础研究。该技术是建立在杂交技术上的一种高效、快速核酸序列分析手段。将大量的基因探针有序地、高密度地排列在一块1～2 cm2大小的玻璃片或纤维膜等支持物上，形成可与目的基因相互作用的固相表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。在一块1 cm2大小的基因芯片上按照需要可以固定成千上万个探针分子，用以实现对千万个基因的同步检测。主要包括4个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。

2　基因芯片在痘病毒研究中的应用

2.1正痘病毒痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)是第一个在世界上广泛应用的病毒疫苗，成功的根除了人类天花病毒，给人类带来了福音。由于该病毒的安全性、哺乳动物的广泛感染性以及其载体能够插入并表达较大的外源基因等特性，使其在溶瘤以及抗病毒研究中进入高峰，临床前期试验和临床试验表明其具有很强且特异的免疫原性和安全性，并取得不错的疗效[11-16]。减毒痘苗病毒(modified vaccinia virus Ankara, MVA)成为了多种病原体和肿瘤治疗的重要载体，激活一些与肿瘤抑制、免疫刺激或药物激活酶等相关基因，在多种疾病治疗中发挥着不可忽略的作用。但是其在人体内具体的作用机制还需要进行深入研究。

Sandra Royo等[17]通过对减毒和未减毒的痘苗病毒株感染人巨噬细胞后宿主基因表达谱变化的研究发现MVA能有效的引发细胞凋亡和IFN-β的分泌，并且激活固有免疫。Jennifer Reinboth等[18]用减毒的痘苗病毒VACV GLV-1h68和3株野生型病毒株在感染黑色素瘤细胞后2、6、10、24和48 h对病毒基因和宿主基因表达谱进行检测，证明了病毒的复制、早期基因的表达和相应的宿主反应存在相关性，推测宿主组分可能参与病毒的早期复制。Daniel Bourquain等[19]检测了猴痘、牛痘和痘苗病毒感染后6 h Hela细胞基因表达谱的变化，尽管这3种病毒有密切的亲缘关系，感染后宿主细胞基因表达谱有相似之处, 但参与免疫调控的基因还是有显著的病毒种属特异性变化。最为明显是在牛痘和猴痘病毒感染后介导参与白细胞迁移和活化的基因表达，但痘苗病毒却不能。感染后宿主细胞水平发生的不同变化可能是特定宿主受到牛痘病毒、猴痘病毒或痘苗病毒感染后表现出不同的个体差异的原因。

NYVAC(New York vaccinia virus)也是一种减毒的痘苗病毒衍生物，其作为载体能够表达广泛物种来源的抗原。通过临床前期试验和临床试验对病毒与宿主的相互作用及免疫学研究，表明高度减毒的痘苗病毒是多种病原体和肿瘤治疗的候选载体[20]。Susana Guerra等[21]使用基因芯片研究NYVAC在感染HeLa细胞后宿主细胞表达谱的变化，其中368个基因表达具有差异性，与免疫反应有关的上调基因包括编码白介素-1 受体2(IL-1R2)，ISG-15，CD-80和 TNFSF7。NYVAC上调几个凋亡级联中间体，例如细胞凋亡蛋白酶-9，因此推测其可能具备介导凋亡的能力。NYVAC感染也能介导NF-κB1、NF-κB2的表达，进一步促进NF-κB靶基因表达，在感染期间，若K1L基因表达能够阻止NF-κB的激活。2007年，他们检测了减毒痘苗病毒MVA和 NYVAC对人类未成熟的单个核来源的树突细胞(immature monocyte-derived dendritic cells，IMDDC)感染后6 h的IMDDC基因表达谱的变化，2种病毒载体均能上调细胞因子、细胞因子受体、趋化因子、趋化因子受体和抗原提呈相关基因的表达[22]。较NYVAC感染样本相比，MVA 感染样本的IL-12β，TNF-α的mRNA水平更高。转录因子NF-κB/Rel 和 STAT在这2种病毒感染后的样本的表达谱相似，然而OASL、MDA5和 IRIG-I只在MVA感染后的样本中表达水平上升。同时在MVA感染后，I型IFN，IL-6和T细胞样受体通路被激活。研究表明这2种病毒载体作为病毒疫苗都有一定的作用。Susana Guerra等[23]通过携带HIV病毒蛋白的痘苗病毒载体感染人IMDDC发现HIV病毒蛋白能介导宿主细胞因子，细胞因子受体，趋化因子，趋化因子受体和参与抗原提呈分子的表达。该研究首次探究了携带HIV病毒蛋白的牛痘载体对树突细胞基因表达谱的变化，鉴定了一些调控基因的生物学作用，为以痘苗病毒为载体的HIV疫苗的后续研究奠定了基础。Delaloye J等[24]通过基因芯片研究发现缺失I和(或) II型 IFN结合蛋白基因的携带HIV-1病毒蛋白的痘苗载体NYVAC-C-ΔB19R、NYVAC-C-ΔB8RB19R使得宿主细胞IFNs和干扰素刺激基因大量表达，很大程度的激活炎性复合物，IL-1β 和 促炎细胞因子基因上调。2种IFN结合蛋白都缺失时可以提高病毒载体的免疫原性，使NYVAC痘病毒成为更富吸引力的HIV疫苗的候选载体。

天花病毒的高致死率及高传染性等特点，使它成为最危险的生物剂之一。Kathleen H. Rubins等[25]使用芯片在天花病毒(variola strains,VV)感染食蟹猴后检测不同的时间点其外周血单个核细胞的基因表达谱变化，发现天花病毒感染可以引起外周血基因表达模式发生改变，该变化显著但比较短暂。对与IFN反应、细胞增殖和免疫球蛋白相关的基因表达谱、病毒剂量依赖的基因表达谱以及天花病毒对细胞免疫反应调控的研究，发现在天花病毒引起严重的全身性感染时TNF-α和NF-κB激活的相关基因转录水平并没有上升，可能是天花病毒基因产物作用而引起的。2008年，他们研制了针对牛痘病毒和猴痘病毒感染后病毒基因表达谱芯片，在感染人单个核细胞、原代人成纤维细胞和海拉细胞早期(感染后1～2 h)，参与DNA复制、RNA转录和调控宿主免疫因子的病毒基因的表达增加，在感染后4～8 h，这些基因表达水平可高达138倍。感染晚期(感染后4 h及以上)，编码结构蛋白和主要病毒组分的基因表达升高，并且早期转录因子被包装入病毒颗粒中。这2种病毒的基因表达谱基本相似，一半的基因在早期表达，另一半在晚期表达，早期表达基因在晚期的表达水平稳定，在感染后24 h病毒基因基本上都表达，能检测到。发现这2种病毒基因在感染后的表达反应具有独特的暂时调控和种属特异性基因表达的特征，为天花病毒感染期间总基因表达谱变化提供了参考[26]。该研究为天花病毒的诊断、治疗和预防提供了新的思路。

Lianghua Bin等[27]通过基因芯片研究发现抑制S100A11的表达使IFN-γ受体和IL-10R2表达下调从而消弱了角质细胞对牛痘病毒复制的控制。Eric Bartee等[28]发现通过检测痘病毒感染的人成纤维细胞表达谱的变化发现TNF和IFN-β能够介导一种新的协同抗病毒效应。Messaoudi等[29]通过不同程度饮酒后恒河猴对MVA反应的研究，发现适度饮酒有利于疫苗效应的发挥，过度饮酒则起抑制作用。

2.2副痘病毒经灭活的羊口疮病毒预处理的猪、转基因小鼠和大鼠模型分别具备抗生殖器疱疹病毒、HBV和单纯疱疹病毒的效应[30], Astrid Friebe等[31]进一步验证了具备抗病毒效应的ORFV的活性组分很可能是病毒蛋白，经含648个信号转导、凋亡、免疫反应、肿瘤、细胞与细胞及细胞与基质粘附素相关基因cDNA芯片检测ORFV及其具有抗病毒活性的重组病毒(VACV/ORFV)介导的转录组学的变化，研究发现ORFV及其具有抗病毒活性的重组病毒所介导的基因表达谱相似，但是在相应的cDNA的表达量上存在差异。信号通路分析显示ORFV的多个蛋白能够激活相似的细胞信号通路，调控抗原提呈细胞，产生很强的以Th1细胞为主的免疫反应，同时其介导的免疫抑制机制平衡其免疫反应。因此ORFV可能成为抗病毒治疗的潜在制剂。

D.G.Diel等[32]利用表达谱芯片研究ORFV024蛋白在病毒感染期间发挥的潜在功能，OV-IA82 024和OV-IA82野生株感染羊鼻甲原代细胞后2 h和4 h后检测宿主细胞基因表达谱的变化，发现OV-IA82 024感染后宿主细胞的一些趋化因子及促炎因子基因表达水平上升，这些基因多数都是NF-κB家族的转录调控因子的靶基因，如CCL20, CXCL1,CXCL2, IL-6, IL-8, NFκBIA 和 PTGS2。进一步研究验证了ORFV024是NF-κB信号通路又一调节抑制剂，基因芯片为该新发现奠定了重要基础。

2.3其他Kristy Offerman等[33]研究了结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease virus,LSDV), 金丝雀痘病毒(Canarypox virus,CNPV), 鸡痘病毒(Fowlpox virus,FWPV), MVA和两种新型南非禽痘病毒(鸽痘病毒(Feral Pigeonpox virus,FeP2) 与企鹅痘病毒(Penguinpox virus,PEPV))注入小鼠静脉后24 h脾脏细胞基因表达谱变化，这6种病毒介导了不同的宿主反应，其中LSDV介导的IFN反应最强。与其他4种病毒相比，FeP2和PEPV所介导的宿主转录组变化最小。CNPV和FWPV 介导2个免疫球蛋白基因Ighg和Ighg3(IgG3)上调，并且CNPV还介导Ighm (IgM)的表达。144例临床试验[34]表明HIV-1特异性 IgG3 抗体与HIV-1感染呈负相关。因此，这2种禽痘病毒可能成为临床上刺激IgG3抗体产生的工具。基因芯片在痘病毒研究中的应用总结如表1。

3　基因芯片的优势与不足

快速、稳定、高效是基因芯片突出的优势，但是也存在很多不足之处。只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对或正常配对与错配兼而有之，该方法本身不能提供足够的信息进行分辨。该方法只能检测已知序列的基因，对于发生突变的序列及新基因不能准确辨认。随着测序技术的不断发展，高通量测序越来越普遍，它可以弥补基因芯片的不足，但是也存在自身的问题。这两项技术的优势与不足见表2。

表1基因芯片在痘病毒研究中新发现

Tab.1The latest studies on poxvirus using gene microarray

属Genus种Species剂量Dose宿主细胞Hostcells动物模型Animalmodels新发现Thelateststudies参考文献References正痘病毒属Orthpoxvirus痘苗病毒株(MVA、ANK,、WR、NYBH、NYVAC或CopV)VACAstrains(MVA,ANK,WR,NYBH,NYVACorCopV)0.1PFU/细胞0.1PFU/cell人巨噬细胞Humanmacrophages—MVA能有效的引发细胞凋亡和IFN-β的分泌,并且激活固有免疫MVAinducedapoptosisandthereleaseofIFN-βaswellasactivatedtheinnateimmunity[17]痘苗病毒VACV0.01PFU/细胞0.01PFU/cell人黑色素瘤细胞Humanmelanomacells—宿主组分可能参与病毒的早期复制Somehostcomponentsmayin-volveinviralearlyreplication[18]牛痘病毒、猴痘病毒和痘苗病毒Cowpoxvirus,mon-keypoxvirusorVACV5PFU/细胞5PFU/cell海拉细胞Helacells—牛痘和猴痘病毒感染后介导参与白细胞迁移和活化的基因表达Aninductionofgenesinvolvedinleukocytemigrationandac-tivationincowpoxandmon-keypoxvirus-infectedcells[19]痘苗病毒株(NY-VAC)VACAstains(NY-VAC)5PFU/细胞5PFU/cell海拉细胞HeLacells—NYVAC感染后促进凋亡基因和NF-κB-反应性基因的表达NYVACinfectionstimulatedtheexpressionofapoptoticgenesandNF-κBtargetgenes[21]痘苗病毒株(MVA和NYVAC)VACAstains(MVAandNYVAC)5PFU/细胞5PFU/cell人未成熟单个核来源的树突细胞IMDDC—两种病毒均能促进免疫功能相关基因表达,可成为潜在疫苗载体Bothviruscanpromotetheex-pressionofimmune-relatedgenesandarepromisingpoten-tialrecombinantvaccines[22]痘苗病毒株(MVA和MVA-B)VACAstains(MVAandMVA-B)10PFU/细胞10PFU/cell人未成熟单个核来源的树突细胞IMDDC—MVA-B具备成为HIV/AID疫苗的潜质MVA-BcanbeacandidatevaccineagainstHIV/AIDS[23]痘苗载体(NYVAC-C-ΔB19R和NYVAC-C-ΔB8RB19R)vaccinevector(NY-VAC-C-ΔB19RandNYVAC-C-ΔB8RB19R)5PFU/细胞5PFU/cell人单个核细胞或THP-1HumanmonocytesorTHP-1—IL-1和I型IFN能够提高缺失了I和II型IFN结合蛋白的痘苗载体IINYVAC-C-ΔB8RB19R免疫原性IL-1andtypeIIFNenhancedtheimmunogenicityoftheIINYVAC-C-ΔB8RB19vaccinevectorwithdualdeletionsoftypeIandtypeIIinterferon-bindingproteins[24]表1(续)属Genus种Species剂量Dose宿主细胞Hostcells动物模型Animalmodels新发现Thelateststudies参考文献References

表2基因芯片与二代测序的优劣势

Tab.2The advantages and disadvantages between microarray and the next generation sequencing

种类Category优势Advantages不足Disadvantages芯片Microarray技术成熟Maturetechnology“封闭系统”:只能检测已知序列(或有限的变异)"Closedsystem":onlydetectknownse-quencesorlimitedvariation积累了庞大的公共数据库Accumulationofenormouscommondata-base短序列及高度同源序列检测存在技术上的困难Technologicaldifficultlytodetectshortsequenceandhighlyhomologousse-quences分析软件相对成熟,便于分析Relativelymaturesoftwareforanalysis假阳性率高Highfalsepositiverate稳定性好Goodstability线性范围较小narrowlinearrange高通量,耗时少Highthroughputandsavetime单样本成本相对较低Relativelowcostforsinglesample测序Sequencing"开放系统":发现和寻找新信息的能力强"Opensystem":powerfulabilitytodiscoverandexplorenewinformation生物信息学分析难度较大,需要专业技术人员进行Withgreatdifficultyinthebioinforma-ticsanalysisandneedprofessionalstaff准确性和灵敏度高Highaccuracyandsensitivity分析软件不成熟,下游分析软件匮乏Immatureanalysissoftwareandlackdownstreamsupportingsoftware获得信息量更大Largeamountsofoutput费时费力Wastetimeandenergy单碱基成本低Lowcostofsinglebase操作复杂Complexoperations线性范围更大Greaterlinearrange

4　展　望

到目前为止，基因芯片仍然是研究病毒引起宿主基因转录调控的重要手段之一。利用基因芯片，从分子水平上了解疾病的发生发展，能够使研究人员在短时间内发现疾病的发生机制，为临床疾病诊断、新药的筛选、临床用药提供指导。随着高通量测序的不断发展，其优势不断凸显，研究者根据研究目的选择合适的研究手段，尽可能利用二者的优势，使其最大程度地为人类研究提供便利。

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Application of gene microarray on host cell gene transcription regulated by poxvirus

CHEN Da-xiang, HAO Wen-bo, CHEN Yü, CHEN Hui-qin, LUO Shu-hong

(InstituteofAntibodyEngineering,CollegeofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Poxvirus is the largest DNA virus, containing complicated structure. It can cause local or systemic purulent damage to skin after infection of humans or animals. Furthermore, it brings about serious economic loss to livestock and threatens human health. Poxvirus could regulate and controlle host cell gene transcription by a variety of strategies, which in turn affect the host immune response. Gene microarray provides a convenient mean for studying the pathogenic mechanism of virus and regulatory mechanism of the host by detection of the host cell gene expression profile before or after the poxvirus infection. This paper reviews the related application of gene microarray on the poxvirus research.

poxvirus; gene microarray; gene expression profile

Luo Shu-hong, Email: sluo815@gmail.com

罗树红，Email:sluo815@gmail.com

南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所，广州510515

R373.1

A

1002-2694(2016)06-0569-07

2015-12-03；

2016-04-03

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.012

国家自然科学基金(No.31170147)资助