基因芯片技术在兽医学方面的应用

彭志领，孟春萍，和小娥，陈 华，李超雷（郑州市动物卫生监督所，河南郑州 450000）



基因芯片技术在兽医学方面的应用

彭志领，孟春萍，和小娥，陈 华，李超雷
（郑州市动物卫生监督所，河南郑州 450000）

摘 要：基因芯片技术作为一门综合性新技术，具有高效、灵敏、准确等优点，目前已被广泛应用于医学的各个领域，并在基因功能表达、致病机理、临床诊断、药物开发等研究方面取得突出成效。本文主要对基因芯片技术在动物疾病的诊断、基因防治、兽药开发、动物发病机制等方面的研究与存在的问题进行综述。

关键词：基因芯片；技术；兽医；应用

随着人类基因组计划的实施而产生的基因芯片技术（Gene chip technology，GCT）具有信息量大、快速、可进行高通量筛选且数据一致性好等优势［1］。目前，基因芯片技术已在多个领域显示出巨大潜力，如基因表达水平的检测、DNA序列测定、分子水平的育种工作、药物筛选、致病机理的研究等。基因芯片技术的诞生，不仅为生命科学领域注入新的力量，也为动物疾病的诊断和防治、发病机制、兽药等的研究提供了有效手段。

1 基因芯片的概述

基因芯片又名DNA芯片、DNA微阵列和寡核苷酸微阵列，是生物芯片的一种［2］。该技术是以基因探针、核酸杂交理论为基础的核酸序列分析方法［3］。其原理是将已知核酸片段固定在一种特定的固相支持载体表面，利用碱基配对原理和印迹杂交技术等，与用荧光或放射性同位素标记过的DNA或RNA样品进行杂交，通过激光共聚焦显微镜等设备和计算机软件系统来分析各种生物分子存在的量［2］。

2 基因芯片技术在兽医临床中的应用

2.1 动物疾病的诊断

随着养殖方式从粗放型向集约型转变，动物疾病变得越发复杂，新的病原不断出现，加之多种病原混合感染，大大增加了兽医工作者对疾病确诊的难度。基因芯片技术弥补了传统诊断方法的不足，能一次检测多种病原，而所需样品量极少，且具有灵敏、特异、高效的特点，在兽医学研究中已颇显成效。

2.1.1 在动物病毒性传染病诊断方面。基因芯片技术在动物传染病的鉴别诊断方面具有独特优势。Baner M K等［4］应用基因芯片技术对猪水疱病、水泡性口炎和口蹄疫三种引起猪相同临床症状的病毒进行鉴别，取得了与PCR鉴定方法完全一致的结果。Baner J等［5］研究的微阵列芯片，使用从正常病毒和特异基因组VP1-VP3-2A血清型获得的口蹄疫DNA，检测出23种不同代表性的口蹄疫病毒株，建立了在单一芯片上进行口蹄疫病毒鉴定和分型的技术。在我国，王建东等［6］制备了口蹄疫病毒基因芯片；韩雪清等［7］完成了对禽流感病毒分型基因芯片的研制。符芳等［8］研制的cDNA微阵列芯片，采用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的特异cDNA片段作为探针制备而成，能够对上述五种病毒同时快速、准确地检测，且样品需要量极少。朱来华等［9］研制的基因芯片能够同时对马疱疹病毒1型、马流感病毒、东部马脑脊髓炎病毒、马动脉炎病毒和马传染性贫血病毒等五种病毒进行检测。根据各种病毒的特异性基因片段而制备的基因芯片，能够灵敏、高效、准确地检测多种病毒，为动物病毒性传染病的鉴别与诊断带来了新的突破。

2.1.2 在动物细菌性传染病诊断方面。丹麦的Georgios K［10］等应用DNA微阵列技术、毛细管PCR电泳法和常规检测法，分别检测了不同来源地的650只发热鸡粪便。结果显示用常规检测方法检出粪便中空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的阳性率为60%，毛细PCR电泳法为95%，而DNA微阵列分析法为100%。这表明基因芯片在动物细菌性疾病的检测方面具有高度灵敏性和高效性，在实验室研究中凸显其优势。但目前将该技术用于临床实践还存在一些问题：一是检测对象还受许多未知的遗传因素影响；二是一些未知的遗传因素对检测对象的影响尚无从确定。因此，有必要对其杂交技术和条件进一步优化，排除假阳性。

2.1.3 在动物寄生虫病诊断方面。杨朋欣等［11］将基因芯片技术用于寄生虫病的诊断，运用旋毛虫、弓形虫的特异序列设计出特异性探针，建立了旋毛虫、弓形虫的液相基因芯片检测方法，从而为寄生虫的检测开拓了新的途径。

2.2 基因芯片在动物用疫苗研制方面的应用

根据病变基因序列有针对性地设计基因药物或核酸疫苗，改变靶序列及表达，以达到防治动物疫病的目的。Behr等［12］研究了结核杆菌有毒株、牛型结核杆菌有毒株和牛型结核杆菌减毒活疫苗株这三类基因组之间的差异，制备了结核杆菌有毒株基因所有开放阅读框架的DNA芯片，进行平行的基因杂交比对。结果表明：牛型结核杆菌有毒株相对于结核杆菌有毒株有11个基因片段的缺失，而卡介苗相对于牛型结核杆菌有毒株有5个基因片段的缺失，这对于研制新疫苗有很大的理论指导意义。

2.3 基因芯片在兽药研究中的应用

2.3.1 药物作用机制的研究。Kume E等［13］用独立芯片研究了链唑霉素对肝脏的毒性作用，结果表明：其上调基因与细胞分裂、凋亡免疫、过敏反应、压力反应以及异源物质代谢等功能相关，其下调基因与糖、脂肪、蛋白质代谢相关。白华等［14］采用基因芯片技术对恩诺沙星压力下大肠杆菌进行表达谱差异分析，结果发现有519个差异点、239个上调、280个下调，表达变化3倍以上的基因有66个，其中有34个上调、32个下调，主要涉及SOS应答、细胞分裂、压力应答、转录调控等诸多生物学功能相关的基因改变。这表明在恩诺沙星压力下，细菌启动SOS应答，细菌分裂被抑制，细菌生理机制发生了复杂的变化。通过研究药物对基因调控和表达的影响，阐明药物的分子机制和对不同生物途径的影响，有助于指导兽医临床用药。

2.3.2 药物作用靶位点研究。Matron等［15］用含有6 065个酵母开放阅读框的DNA表达谱基因芯片进行研究，提出了“解码器策略（Decoder strategy）”，其原理可以概括为：首先比较经药物作用的野生株和缺失某些基因的突变株的表达图谱，若二者相似，则将突变株与药物作用。如果突变基因所编码的蛋白质参与的生物途径受到药物作用的影响，则药物诱导的突变株基因表达变化与药物诱导的野生株基因表达变化就会不一样。根据这种策略研究药物对基因表达的影响，进而对药物的作用机制及药物相关靶位点进行确定。

2.4 动物发病机制的研究

每种细胞在执行各自功能时，基因表达的种类和数量都非常精确。如果个别基因异常表达，就导致生理紊乱，致使整个表达系统失衡。因此，可以用表达谱基因芯片检测病变组织细胞的基因表达变化情况，从而阐明疾病的发生机制，为诊断或寻找治疗靶位基因提供线索。Luan等［16］制备了包含有13 319个鸡基因探针的芯片，对2周龄小鸡感染沙门氏病菌前后进行检测，结果检测到了588个异常表达基因，其中276个是已知功能基因。美国明尼苏达大学的Deng等［17］用表达谱芯片研究了宿主细胞在感染微小隐孢子虫24小时后其基因表达的变化情况。结果表明：宿主细胞中223个基因的表达出现了变化，其中有125个基因的表达上调，98个基因的表达下调。用荧光定量PCR进一步验证了编码宿主细胞的热休克蛋白、炎症趋化因子IL-8、肌动蛋白、微管蛋白等13个基因与上调基因一致。该研究应用表达谱芯片揭示了宿主感染微小隐孢子虫后宿主细胞生化途径的改变，阐明了微小隐孢子虫的发病机制，进一步揭示了宿主和寄生虫间的相互关系。

2.5 寻找新的致病基因和疾病相关基因

基因芯片技术在实际操作中，能以极少量的样品，自动化地平行分析数以万计的基因在不同时空中的表达模式和变化，能满足多基因参与调控的复杂过程，能以各自不同的研究目的灵活设计不同微阵列，快速对成千上万的基因进行平行筛选，找出差异表达的基因，这有助于我们发现新基因，从而为寻找新的药物治疗靶位和新的疾病治疗方案提供依据［18］。

2.6 未知基因的功能研究

将来源于不同个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激下细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与芯片上的基因片段进行杂交，可以对这些基因表达的各种特异性进行综合分析和判断，从而将某个或几个基因与疾病的发生、发展联系起来，确立相关基因功能以及基因与基因间的相互作用关系［19］。

也可以根据与已知基因表达图谱一致或相似的未知基因的表达图谱，推测新基因的功能。基因芯片可同时对成千上万个基因的表达图谱进行研究，这样可以全面检测细胞在一定条件下的基因表达，来研究未知基因的功能［20］。

Ledgertn等［21］利用基因芯片研究与猪免疫功能相关的基因表达情况。结果表明：接受了应急处理的猪群中，表达出现上调的基因有r受体基因、a肿瘤坏死因子基因等，而表达出现下调的是与巨噬细胞表达相关的IL-l、IL-8、AMCF-l、DAP-12等基因。这一方法与荧光定量PCR方法进行比较得到了一致的结果，说明在应激条件下动物体生理功能变化情况与某些基因表达相关。

2.7 转基因动物产品检测与动物检疫

转基因食品在给人们带来前所未有的经济价值的同时，也带来一些生物安全隐患，在不确定外源基因的食用安全性及其次生效应安全性的情况下，转基因食品的推广无疑是把双刃剑。因此，应加大转基因食品的检测力度。基因芯片是转基因食品检测最具潜力的手段之一。另外，广泛收集用于转基因技术的目的基因启动子和标记基因的EST序列，制成基因芯片，可用于跨区域引种、调种及海关进出口动物检疫等。Leimanis S等［22］制备出一种可以同时检测9种转基因生物的基因芯片，用生物素标记靶基因，比色法检测，其监测系统被证明符合欧盟转基因检测要求。周琦等［23］研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片，共660条病毒探针，覆盖了SARS病毒的全部序列，应用该基因芯片对出入境动植物及其产品、进出口食品进行检测，有极大的应用空间和价值，也为保障动物性食品安全提供了更为科学的检测手段。

3 基因芯片技术存在的问题以及对未来的展望

基因芯片技术作为一项新诞生的技术，在短时间内得到迅猛发展，但要想广泛应用于兽医临床中，尚有一些关键的技术问题需要解决。

首先，与动物疫病相关的微生物有几百种，但目前被测序的仅仅有几十种，致病微生物的基因组信息远远满足不了实际检测与诊断的需要，有些基因芯片技术一经诞生，其关键技术便被保护起来，不能分享，这从一定程度上阻碍了基因芯片技术在兽医临床中的应用。不过，随着基因组测序计划的不断发展，各个物种的序列片段将会更加明确，这将有力推动基因芯片技术的发展与进步。

其次，目前基因芯片的制做程序比较复杂，成本较高，尽管芯片或微阵列可以多次重复使用，但每次杂交反应后，其敏感性都要降低。而且，传统的芯片因基于荧光标记技术，应用时需要昂贵的扫描设备，只能在较大的实验室或者科研机构进行，很难在兽医临床中推广应用。

除此之外还存在诸如：样品制备和标记比较复杂且不均一，实验室操作程序有待标准化；与Northern blotting或RT-PCR相比，不能检测微mRNA；在杂交反应中，DNA芯片上原位合成探针有可能有错误的核酸或杂质混入、杂交背景变得复杂、特异性会降低等问题。

随着芯片技术的不断成熟，很多问题正在逐步得到解决。如DNA合成方法的改进，目前可以将长片段寡核苷酸探针用于点阵芯片。探针的构造变得简单了，只要求清洗，不需要PCR扩增，这样就提高了杂交、批处理和点阵的一致性［24］。伴随着人类基因组计划的进行和发展，一种可以在基层兽医临床中推广使用、经济又可靠的新型基因芯片技术必将诞生，其在兽医临床的疾病诊断、疾病的发生机制研究和新药的开发中将发挥巨大作用。基因芯片技术未来一定会像电子产品一样，为人类社会带来巨大效益。

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（责任编辑：朱迪国）

Application of Gene Chip Technology in Veterinary

Peng Zhiling，Meng Chunping，He Xiao'e，Chen Hua，Li Chaolei
（Zhengzhou Animal Health Inspection Institute，Zhengzhou，Henan 450007）

Abstract：The gene chip technology is a kind of comprehensive new technology with highly active，highly sensitive and accurate advantages.At present，it has a wide range of applications in various fi elds of medicine，and has obtained remarkable achievement in gene function expression，pathogenic mechanism，clinical diagnosis and pharmaprojiects etc.The application and existed problems of the gene chip technology in the diagnosis of animal diseases，gene control，veterinary drug development and animal pathogenesis were reviewed in this paper.

Key words：gene chip；technology；veterinary medicine；application

中图分类号：S852.23

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）02-0062-04