关于男性生育力的人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶作用解析

李林　吴励梅　罗一平　田小燕　李彩英　徐妙容（广东省佛山市顺德区第一人民医院生殖健康与不孕科　佛山528300）

关于男性生育力的人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶作用解析

李林吴励梅罗一平田小燕李彩英徐妙容
（广东省佛山市顺德区第一人民医院生殖健康与不孕科佛山528300）

目的：解析精子透明质酸酶（HYD）和精子顶体蛋白酶（ACE）在男性生育力中所起的作用。方法：以不育者为实验组，以来我院检查身体的健康正常生育男性为对照组，用明胶底物膜法对精子样本检验，并进行组间对比。结果：实验组精子畸形率较高，ACE阳性率、活性强度、HYD阳性率、活性强度均低于对照组，且精子密度及活性与上述指标呈正相关（P＜0.05）。结论：HYD 及ACE在男性生育能力中起到至关重要的作用。

男性生育力；精子；ACE；HYD

有研究认为精子透明质酸酶（HYD）和精子顶体蛋白酶（ACE）与男性生育能力相关，但其具体所起的作用却未经证实［1～2］。本研究采用细胞染色技术对不育症患者精液样本进行观察，并通过与正常人的精液比较来探讨其作用。现报道如下：

1　资料与方法

1.1临床资料本研究选取2013年4月～2015年9月期间在我院生殖健康与不孕科就诊的不育症患者为实验组，同时以身体健康正常生育男性为对照组。诊断标准：前向运动（PR）级精子百分率＞32%、精子密度＞15×106/ml为正常［3］。纳入标准：已婚且有1年以上同居经历；夫妻性生活正常；处在正常可生育年龄范围内（本研究选取24～35岁患者）。排除标准：因女方原因导致不育。经纳入、排除后共选入对象70例。实验组20例，年龄24～35岁，平均年龄（29.32±2.16）岁，按精子活动率和精子密度各分为三组。对照组50例，年龄24～35岁，平均年龄（29.15±2.09）岁。两组一般资料对比，无明显差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法用明胶底物膜法对精子样本进行检验，对比正常男性与不育者精子样本差异，分析人精子顶体蛋白酶与透明质酸酶的作用。研究对象需要禁欲3～7 d，采用手淫法取精液，全部收集于干燥无菌取精杯中，放置37℃恒温箱内孵育，待液化后精液样本处理。通过人工镜检法准确计数精子畸形率、活动率、密度。移取精液于15 ml锥形管内，相对离心力900 g离心10 min，将精浆上层去除，用磷酸盐缓冲液（PBS）对沉淀物洗涤，用2倍体积的PBS将洗涤后的沉淀物悬浮，取1～2滴悬浮液，滴于明胶膜片上，保持温度在37℃恒温内3 h，干燥后涂片、孵育、对其进行观察。

HYD检测法：在0.2 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中放入药盒底膜片，缓冲液PH值为4，保持20 min，以矫正PH值。将以上的PBS精子悬浮液取1～2滴在药盒底膜片上涂抹，并放在温度为37℃的恒湿恒温箱中孵育。孵育3 h后取出，并在室温下进行干燥，干燥后置于普通光镜下对孵育结果观察。ACE检测法：把药盒底膜片放入巴比妥钠醋酸缓冲液当中，10 s后取出，进行干燥处理。干燥后将精子PBS悬浮液均匀铺开在底膜片上1～2滴，放于温度为37℃的恒温恒湿箱当中孵育，于2 h后取出，并在室温下做干燥镜检［4］。

观察组患者根据精子密度不同进一步分组，其中M1组精子浓度＞40×106/ml，M2组精子浓度15～40×106/ml，M3组精子浓度＜15×106/ml。同时，根据精子活动率不同进一步分组，其中H1组PR＞50%，H2组PR32%～50%，H3组PR＜32%。

1.3评定标准［5～6］本次实验检测用显微镜型号均为Leica DME，一般检测所用视野六个左右即可，随即选取200个精子头部对其进行观察检测。检测结果显示其头部周围存在不同程度的晕环情况即可判定为HYD或ACE阳性。确定阳性后，医护人员需要选取专业合理的测微尺测量精子头部周围晕环的直径，整理分析不同测量数据，最终得出平均值，根据该数值能够对HYD或ACE的活性强度进行判定。

1.4观察指标主要对两组患者的精子密度及活性指标进行观察，同时观察分析实验组患者精子密度与ACE和HYD及精子活动率与ACE和HYD之间的关系。

1.5统计学方法将所有研究数据纳入SPSS19.0软件，计量资料以（±s）表示，用t检验；计数资料以率（%）表示，用χ2检验。判定统计学差异的标准为P＜0.05。

2　结果

2.1健康人与不育患者的精子密度及活性相关指标比较HYD阳性率、活性强度及ACE阳性率和活性程度比较，实验组低于对照组，而精子畸形率比较，则实验组较高，P＜0.05。见表1。

表1　实验组与对照组精子密度及活性指标比较（±s）

表1　实验组与对照组精子密度及活性指标比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别　n　HYD活性强度（μm）　HYD阳性（%）　精子畸形率（%）　ACE活性强度（μm）　ACE阳性（%）实验组对照组20 50 tP 28.31±17.32*49.21±17.25 11.359 0.015 37.25±15.32*76.35±9.26 20.315 0.001 53.30±10.22*42.15±6.31 12.580 0.021 27.02±12.31*46.21±7.98 19.214 0.002 44.01±7.32*84.02±8.51 20.145 0.001

2.2不同精子密度下的相关指标比较相比对照组而言，精子密度越低则ACE及HYD阳性和活性相关指标越低，组间对比均经统计学验证证实，P＜0.05。见表2。

表2　精子密度为因变量下的相关指标比较±s）

表2　精子密度为因变量下的相关指标比较±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别　n　ACE阳性（%）ACE活性强度（μm）HYD阳性（%）HYD活性强度（μm）M1组M2组M3组对照组9655 0 55.25±12.64*39.25±6.20*29.49±5.21*84.02±8.51 38.52±17.25*22.34±5.01*11.94±2.64*46.21±7.98 52.31±10.34*35.35±7.89*12.42±72.25*76.35±9.26 39.80±12.45*21.63±8.65*15.65±3.42*49.21±17.25

2.3不同精子活动率下的相关指标比较相比对照组而言，精子活动率越低则ACE及HYD阳性和活性相关指标越低，组间对比均经统计学验证证实，P＜0.05。见表3。

表3　精子活动率为因变量下的相关指标比较（±s）

表3　精子活动率为因变量下的相关指标比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别　n　ACE阳性（%）ACE活性强度（μm）HYD阳性（%）HYD活性强度（μm）H1组H2组H3组对照组10 555 0 51.14±12.32*40.25±6.21*33.51±5.23*84.02±8.51 38.52±17.25*22.34±5.21*12.97±2.65*46.21±7.98 47.25±15.02*29.35±7.54*25.15±76.25*76.35±9.26 37.31±15.32*22.98±3.65*15.65±3.42*49.21±17.25

3　讨论

HYD在精子顶体内酶组中发挥重要作用，其细胞颗粒在卵泡附近呈分散式分布，能促使精子通过。并利用相关酶系以及其他顶体蛋白酶，在配合作用下创造适宜于精子和卵子结合的环境条件［7］。在当前医学界对人体微观认知中，酶共有24种，除了HYD之外，另一种重要的酶就是ACE。ACE在精子获能时形成透明带，并与HYD相配合促进精子通过。所以两者均成为对精子活性进行评价的有效指标。加之两者之间的配合关系，对HYD和ACE进行协同检测则能通过综合反馈的信息，对男性生育能力做出准确的评估［8］。另外，精子内含HYD及ACE数量可以通过其头部亮环进行观察而得出，一般来说亮环亮度越强、范围越大则HYD及ACE数量也就越多，并且酶活性越高。

本次研究证实，ACE和HYD指标均能有效反应男性生育能力，通过两者综合测量能在常规检查的基础上提高诊断准确率。从研究结果中发现，男性不育症患者精子畸形率较高，并且HYD阳性率、活性强度及ACE阳性率和活性程度比较结果显示实验组低于对照组。相比对照组而言，精子密度越低则ACE及HYD阳性和活性相关指标越低。精子活动率越低则ACE及HYD阳性和活性相关指标越低。综上所述，HYD及ACE在男性生育能力中起到至关重要的作用，在对因不育的男性患者进行临床检查时，应采取ACE及HYD协同检测方法，以加强诊断的及时性和准确性。

［1］马晓萍，高晓勤，杨燕平，等.人精子顶体内顶体蛋白酶和透明质酸酶对男性生育力的影响［J］.检验医学，2014，29（3）:258-261

［2］郑立宏，杨丹，高晓勤.有机磷农药对精子顶体内透明质酸酶的影响［J］.解剖学杂志，2014，37（5）:636-638

［3］谷翊群.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册［M］.人民卫生出版社，2011

［4］梁鑫，成姝婷，王正荣，等.Clock基因对精子顶体酶的影响［J］.中国男科学杂志，2015，29（11）:3-7，22

［5］钟志敏，王维，莫云丹，等.血清顶体蛋白酶抗体与精子蛋白17抗体对不孕不育症的临床价值探讨［J］.检验医学，2013，28（4）:276-279

［6］杨晶，李洪锐，易善勇，等.红花油体表达人透明质酸酶基因的初步研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2015，23（9）:191-195

［7］杨建辉，陈利红，高晓勤.不育患者精子质量与顶体内透明质酸酶活性研究［J］.黔南民族医专学报，2014，27（2）:79-82

［8］马晓萍，高晓勤，丁贤胜，等.人精浆中性α-1，4-糖苷酶活性与精子透明质酸酶活性的关系［J］.基础医学与临床，2011，31（2）:166-169

R698.2

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.05.012

2016-04-18）