正交设计法优选忍冬藤中绿原酸提取工艺

毛　莹　李东霞　夏春丽

(大连大学医学院，大连，116622)



正交设计法优选忍冬藤中绿原酸提取工艺

毛莹李东霞夏春丽

(大连大学医学院，大连，116622)

目的：对忍冬藤中绿原酸的提取工艺进行研究。方法：采用正交设计法设计忍冬藤中绿原酸的微波提取工艺和超声波提取工艺，采用高效液相法测定各提取工艺下的绿原酸含量，并将两种提取方法得到的结果进行比较。结果：微波提取法的最佳提取工艺为：微波时间为60 s，乙醇浓度为50%，料液比为1∶15，绿原酸含量为0.357%。超声波法最佳提取工艺为：提取功率为50 Hz，甲醇浓度为50%，料液比为1∶20，绿原酸含量为0.321%。以绿原酸含量为指标，微波提取法优于超声波提取法。结论：忍冬藤中绿原酸的最佳提取方法为微波提取法，此方法时间短，耗能低，提取率优于超声波提取法，可用于忍冬藤中绿原酸的提取。

忍冬藤；绿原酸；正交设计；提取方法；含量测定

忍冬藤为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥茎枝，具有清热解毒、疏风通络之功效。绿原酸是忍冬藤的主要有效成分之一[1-2]，现代研究表明忍冬藤与金银花具有相近的化学成分和药理活性[3]，均可做为临床常用清热解毒药，而且还作为提取绿原酸的工业原料，用量较大，价格较高，货源较紧。因此从忍冬藤中提取绿原酸应用于临床和市场迫在眉睫。目前对忍冬藤的研究报道主要集中在化学成分、药理作用等方面，对其有效成分提取方法的系统性研究较少，这直接影响到忍冬藤的开发与利用。因此，本文根据忍冬藤中绿原酸提取方法的一些前期研究，以绿原酸含量为指标，采用正交设计法对忍冬藤中绿原酸的微波和超声提取工艺进行研究，旨在为更好的开发利用忍冬藤打下基础。

1　材料

忍冬藤(采自大连大学药植园)，经大连大学医学院中药学研究所鉴定为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥茎枝；绿原酸对照品(批号：110753-201213)，购自中国药品生物制品检定所。

HITACHI L2000型高效液相色谱仪(HITACHI L-2013送液泵，HITACHI UV-detector 2-2400检测器)；甲醇(Tedia.)，乙腈(Tedia.)为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2　方法

2.1HPLC色谱条件色谱柱：Hypersil Gold柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 mL/min；检测波长：327 nm；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)。

2.2对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品2.6 mg，用50%甲醇定容于50 mL的容量瓶中，摇匀，置冰箱内保存备用。

2.3微波提取试验[4-8]取忍冬藤粉末(过三号筛)各1 g精密称定，按实验设计(见表1)进行微波提取，得到9组提取液，冷却后过滤，取续滤液5 mL置25 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，静止，上清液用0.45 μm滤膜滤过即可。

2.4超声波提取试验[9-12]取忍冬藤粉末(过三号筛)各1 g精密称定，按实验设计(见表2)进行超声波提取，得到9组提取液，冷却后过滤，取续滤液5 mL置25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静止，上清液用0.45 μm滤膜滤过即可。

表1　微波法正交试验因素水平表

表2　超声波法正交试验因素水平表

2.5线性关系考察精密吸取绿原酸标准品溶液3、5、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)为流动相，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品的含量为横坐标，对照品峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程：Y=3E+06X+7276，R2=0.9992(n=5)，表明绿原酸在0.15～1.04 μg范围内呈线性关系。

2.6精密度试验在规定色谱条件下精密吸取同一浓度的对照品溶液10 μL，连续进样6针，计算，RSD=1.05%。

2.7重现性试验称取供试品0.5 g，共6份，精密称定后，依法测定绿原酸含量，RSD=1.12%(n=6)。

2.8稳定性试验在规定色谱条件下，精密称取同一样品溶液10 μL，于0、2、4、8、12、24 h进样，测定，计算含量，RSD=1.32%(n=6)结果表明绿原酸在避光条件下放置24 h基本稳定。

2.9加样回收率试验取已知含量的忍冬藤药材，加入一定量绿原酸标准品，按上述色谱条件测定，计算回收率。测得平均回收率为99.1%，RSD=1.8%(n=6)。

2.10样品测定以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)为流动相，按照上述色谱条件，测定不同提取方法提取的忍冬藤中绿原酸的含量。

2.11统计学方法采用SPSS 11.5统计软件对所得实验数据进行正交实验方差分析。

3　结果

3.1微波提取法从表3和表4中可以看出，各因素对绿原酸影响的顺序为A>C>B。以绿原酸含量为指标得出的最佳工艺条件是A1B3C3，即提取时间为60 s，乙醇浓度为50%，料液比为1∶15，绿原酸含量为0.357%。

表3　微波提取法L9(33)试验数据表

表4　微波提取法绿原酸含量方差分析表

注：在试验水平α=0.05(或0.01)的情况下,分别检验各因素的显著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即认为该因素对试验指标有显著影响，反之没有显著影响。经查表得F0.05=19。

3.2超声波提取法从表5和表6中可以看出，各因素对绿原酸影响的顺序为A>C>B。以绿原酸含量为指标得出的最佳工艺条件是A2B1C2，即甲醇浓度为50%，超声功率为50W，料液比为1∶20，绿原酸含量为0.321%。

3.3不同提取工艺的对比分析在上述正交实验的基础上，分别在微波提取法和超声提取法中筛选出绿原酸含量最高的一组进行比较，得出最佳提取工艺为微波提取法提取时间为60s，乙醇浓度为50%，料液比为1∶15，绿原酸含量为0.357%。

表5　超声波提取法L9(33)试验数据表

表6　超声波提取法绿原酸含量方差分析表

注：在试验水平α=0.05(或0.01)的情况下,分别检验各因素的显著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即认为该因素对试验指标有显著影响,反之没有显著影响。经查表得F0.05=19。

表7　微波提取法与超声提取法提取工艺对比分析表

4　讨论

本实验在前期预试验及相关文献的基础上,进行了正交试验因素水平的设置,选择了最为影响微波提取法和超声波提取法工艺的主要条件，进行了正交试验，从实验结果来看，所选择的实验条件能够筛选出微波提取法和超声波提取法的最佳提取工艺，为后续实验提供方法和参考。

本实验中两种提取方法的最佳提取工艺在绿原酸含量上接近，但微波提取法具有热效率高、设备简单、适用范围广、重现性好、节省试剂、污染小等特点，从提取溶剂上来讲，本实验采用乙醇作为绿原酸的微波提取溶剂，结果表明乙醇能够较完全的提取药材中的绿原酸成分，并且乙醇与甲醇相比，具有污染小，价格便宜等优点，甲醇比乙醇挥发快，毒性大，工业上大量提取不宜采用。同时，微波提取工艺可有效地克服传统煎煮提取方法中药材细粉易出现糊化、堵塞等问题，适宜于工业化大生产[13-15]。所以本实验初步认为微波提取法可作为忍冬藤的最佳提取工艺，具体方法有待于进一步研究。

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[3]鲁思爱.忍冬藤的化学成分及其药理应用研究进展[J].临沂大学学报,2012,34(3):132-134.

[4]李克,王曙东,吴龙琴,等.多因素正交试验法优化忍冬藤提取工艺研究[J].现代中药研究与实践,2013,27(2):39-41.

[5]李克,吴龙琴,汤淏,等.RP-HPLC法同时测定忍冬藤中绿原酸和咖啡酸含量[J].现代中药研究与实践,2013,27(1):17-19.

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(2015-07-17收稿责任编辑：张文婷)

Optimization of Extraction Process of Chlorogenic Acid in Lonicerae japonicae Caulis by Orthogonal Design

Mao Ying, Li Dongxia, Xia Chunli

(MedicalCollege,DalianUniversity,Dalian116622,China)

Objective: To study the extraction methods for chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis. Methods: The microwave extraction and ultrasonic extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis were set based on orthogonal design. The chlorogenic acid contents of different extraction techniques were detected by HPLC. The results of the two extraction methods were compared. Results: The results show that the chlorogenic acid was highest, up to 0.357%, when microwave time was set at 60s with 50% ethanol concentration and solid-liquid ratio of 1∶15 by microwave extraction. The chlorogenic acid was highest when methanol concentration, up to 0.321%, was set at 50%, ultrasonic power 50W and solid-liquid ratio 1:20 by ultrasonic extraction. By taking chlorogenic acid content as an indicator, microwave extraction method was better than ultrasonic extraction. Conclusion: According to the results, the best extraction method for Chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis was microwave extraction with less time cost and low energy consumption and the extraction rate is better than that of the ultrasonic extraction. It can be applied in the extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis.

Lonicerae japonicae Caulis; Chlorogenic acid; Orthogonal design; Extraction methods; Determination

辽宁省大连市科技计划项目(编号：2008E11SF171)

毛莹(1982.01—)，女，博士研究生，研究方向：中药鉴定方法学、中药药效组分及药效组分质量评价体系研究，E-mail:maoyingying2004@sina.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.049