温运清利法对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织DAG-PKCε信号通路的作用研究

毛堂友 高康丽 赵唯含 王允亮 郭一 谢添弘 陈晨 谭祥 韩亚飞 李军祥



温运清利法对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织DAG-PKCε信号通路的作用研究

毛堂友 高康丽 赵唯含 王允亮 郭一 谢添弘 陈晨 谭祥 韩亚飞 李军祥

目的 探讨温运清利法对非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝组织甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）信号通路的影响。方法 高脂饮食饲养SD大鼠8周制备NASH模型，造模成功后，将大鼠随机分为模型组、苓桂术甘汤组、茵陈蒿汤组、合方组（苓桂术等与茵陈蒿汤）、罗格列酮组，共5组，每组10只；另有空白组10只。药物治疗4周后，运用自动生化分析仪检测血清生化指标，HE染色、油红O染色观察肝组织病理，ELISA法检测肝组织DAG，RT-PCR检测PKCε mRNA、TNF-α mRNA，Western blot检测PKCε和TNF-α蛋白的表达。结果 （1）各给药组大鼠一般状况、肝组织脂肪变性和炎症反应程度、血清生化指标等均较模型组有一定的减轻；（2）苓桂术甘汤、合方组、罗格列酮组大鼠肝组织DAG较模型组明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；（3）各治疗组大鼠肝组织PKCε mRNA和蛋白含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），茵陈蒿汤组、合方组及罗格列酮组大鼠肝组织TNF-α mRNA和蛋白含量显著降低（P＜0.05）。结论 温运清利法可能是通过下调肝组织DAG，抑制PKCε表达，降低TNF-α水平，从而对肝内脂质代谢、胰岛素抵抗、炎症损伤起到了调节作用，DAG/PKCε通路有可能成为治疗NASH的新靶点。

温运清利法； 非酒精性脂肪性肝炎； DAG-PKCε信号通路； 作用研究

目前，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的发病机制尚不清楚，较为普遍接受的是“二次打击”学说，初次打击的核心主要是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）及脂质代谢紊乱，及在此基础上引发的第二次打击——氧化应激和脂质过氧化反应，而甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）信号通路参与这个过程。本课题组前期研究发现［1-3］，苓桂术甘汤可调节肝内脂质代谢和改善IR，减轻肝脏炎性损伤；而茵陈蒿汤亦可改善脂代谢紊乱及高胰岛素血症状态，抑制脂质过氧化反应，但二者合方能否增强治疗效果，尚未可知。因此，本研究以DAG-PKCε信号通路为切入点，探讨进一步苓桂术甘汤、茵陈蒿汤及其合方治疗NASH的作用机制。

1 材料

1.1 动物

健康SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（120± 20）g，购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司合格证号：SCXK（京）2011-0004，常规饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房。高脂饲料（88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇）购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 药物

苓桂术甘汤颗粒（茯苓12 g、桂枝9 g、白术6 g、炙甘草6 g）；茵陈蒿汤颗粒（茵陈蒿18 g、栀子9 g、大黄6 g）；茵陈蒿与苓桂术甘汤合方颗粒（茯苓12 g、桂枝9 g、白术6 g、炙甘草6 g、茵陈蒿18 g、栀子9 g、大黄6 g），均购自北京中医药大学东方医院配方颗粒药房；阳性药物罗格列酮片，购自成都恒瑞制药有限公司（批号：H20051706）。

1.3 试剂与仪器

总胆醇（total choleste，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、高密度脂蛋白（high density lipid-cholesterol，HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）试剂盒，均购自中生北控生物科技股份有限公司。油红O染色及苏木精-伊红染色相关试剂（Sigma，USA）。TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司），BCA蛋白定量试剂盒、2 mg/mL BSA标准品、考马斯亮蓝染色液等均购自北京赛诺博生物技术中心。PKC-ε抗体 （CST，2683）；TNF-α抗体（abcam，ab6671）。7160全自动生化仪（日本日立公司）；BT224S电子天平（德国 Sartouris公司）；QL-902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；HB-202恒温水洛箱（北京中西远大）；UCT型超薄切片机（德国莱卡公司）；MR23i台式高速低温离心机（美国Thermo公司）；Nikon50I光学显微镜（日本Nikon公司）；美国Bio-Rad稳压稳流电泳仪；NANODROP2000分光光度计（Thermo scientifi公司）等。

1.4 分组、造模及标本采集

造模方式同前期研究［4-6］，将60只大鼠适应性喂养7天后，空白组（10只）给予普通饲料，其余大鼠（50只）给予高脂饲料，自由摄食、饮水。造模8周后，高脂饲料饲养组依据体重随机分为模型组、苓桂术甘汤组、茵陈蒿汤组、合方组（苓桂术甘与茵陈蒿汤）、罗格列酮组。各给药组分别以苓桂术甘汤、茵陈蒿汤、苓桂术甘与茵陈蒿汤合方、罗格列酮混悬液，按1 mL/100g大鼠等效剂量比例灌胃治疗；模型组和正常对照组按1 mL/100g鼠重给予去离子水灌胃，均为每天上午灌胃1次，治疗4周。每天观察动物进食、饮水、行为、精神状态、毛发及二便等情况，每周动物称体重1次。末次给药后，禁食禁水24小时，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，抽取大鼠腹主动脉血，分离血清-80℃冰箱保存；在肝脏最大叶边缘处取9小块肝脏组织（1×1 cm），1份用 10%中性福尔马林固定液固定，制作石蜡切片；一份用OCT固定液固定，制作冰冻切片；剩下的放置于冻存管，-80℃冰箱冻存备用。

1.5 血清指标检测

血清（ALT、AST）、血脂（TC、TG、HDL、LDL）均采用自动生化分析仪检测。

1.6 肝组织病理检测

常规方法进行石蜡包埋切片（4 μm），HE染色；冰冻切片（10 μm）行油红O染色，并在光镜下观察肝脂肪变性程度、炎症活动度。

1.7 肝组织PKCε mRNA、TNF-α mRNA的检测

肝组织样本中提取总RNA后，计算其纯度和浓度。逆转录后进行 PCR扩增，PKCε上游引物5′-AAGGGATTCTGAATGGCGTGACA-3′，下游引物5′-CACTGAGGGGCCGTACTCCAAC-3′，扩增片段长度98 bp；TNF-α上游引物5′-GGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTG-3′，下游引物5′-GGGCTCTGAGGAGTAGACGATAAAG-3′，扩增片段长度128 bp；内参GAPDH上游引物5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′，下游引物5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′，扩增片段长度138bp。PCR产物经电泳后，采用2-△△C T法进行数据的相对定量分析，计算PKCε、TNF-α值。

1.8 肝组织PKCε、TNF-α蛋白的检测

将肝组织裂解后，离心取上清液，置于BSA标准液中，检测样品蛋白含量。调整浓度后，进行电泳分离，分别加入一抗、二抗，漂洗后凝胶图像分析，得出数值。

1.9 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，本实验中各组大鼠体重及肝指数、血清血脂、血清肝功能及DAG的数据均符合正态分布，且方差齐，因此采用单因素方差分析中的两两比较LSD法；PKCε mRNA和蛋白、TNF-α mRNA和蛋白的数据方差不齐，因此采用Games-Howell法进行两两比较，以P＜0.05为差异存在统计学意义的界限；P＜0.01为具有显著差异。

2 结果

2.1 一般情况

模型组大鼠较空白组大鼠精神差、毛发凌乱无光泽、行动笨拙、活动减弱、精神萎靡、体质量明显减轻。各给药组大鼠精神状态、毛发光泽、活动行为以及体质量增长较模型组相比，均有不同程度的好转。见表1。

表1 各组大鼠体重及肝指数比较（±s）

表1 各组大鼠体重及肝指数比较（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

组别　n　　体质量（g）　　肝指数（%）空白组10　520.14±43.27　2.39±0.28模型组　10　712.38±53.19a　4.19±0.17a苓桂术甘汤组　10　650.24±48.50b　3.26±0.20b茵陈蒿汤组　10　641.93±45.78b　3.11±0.24b合方组　10　618.37±50.74b　2.93±0.18b罗格列酮组　10　629.85±46.85b　3.09±0.16b

2.2 血清指标

2.2.1 对血清肝功能的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清ALT、AST含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，苓桂术甘汤组、合方组、罗格列酮组大鼠血清ALT、AST明显降低（P＜0.05），茵陈蒿汤组大鼠血清ALT明显降低（P＜0.01），血清AST的含量无明显改变（P＞0.05）。见表2。

2.2.2 对血清血脂的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL含量均显著升高（P＜0.05），HDL含量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，苓桂术甘汤组、茵陈蒿汤组、罗格列酮TG明显降低（P＜0.05），TC、LDL、HDL含量无明显变化（P＞0.05）；合方组TC、TG、LDL明显降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL含量无明显变化（P＞0.05）。见表3。

表2 各组大鼠血清肝功能的含量比较（U/L，±s）

表2 各组大鼠血清肝功能的含量比较（U/L，±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01。

组别　n 10　16.95±8.49　82.41±49.65模型组　10　41.78±14.04b　172.09±47.30a苓桂术甘汤组　10　21.52±6.86d　108.25±50.51c茵陈蒿汤组　10　25.49±12.90d　165.41±88.46合方组　10　18.06±4.12d　76.17±27.20c罗格列酮组　10　22.61±9.73d　104.09±38.43 ALT　AST空白组c

2.3 肝组织病理学检测

HE染色显示：空白组大鼠肝组织着色均匀，肝小叶结抅正常，肝索排列整齐呈放射状（图1A）；模型组大鼠存在明显的肝细胞脂肪变性，肝小叶界限不清，肝索结构紊乱，肝组织可见弥漫性、混合性的空泡及气球样改变，汇管区和小叶内可见大量中性粒细胞浸润呈灶状积聚（图1B）；各治疗组病变较模型组均有不同程度的减轻，肝细胞形态和小叶结构有不同程度恢复，胞内脂滴及炎性细胞浸润减少。（图1 C、D、E、F）。

油红O染色显示：空白组肝组织不着色（图2 A）；模型组大鼠肝组织可见大量脂滴（图2 B）；各治疗组肝组织中脂滴明显减少，呈不均匀分布（图2 C、D、E、F）。

2.4 对肝组织DAG的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织DAG含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，苓桂术甘汤、合方组、罗格列酮明显降低（P＜0.05，P＜0.01），茵陈蒿汤组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

2.5 对肝组织PKCε mRNA和蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织PKCε mRNA和蛋白均显著升高（P＜0.05），茵陈蒿汤组、合方组及罗格列酮组的PKCε mRNA显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠肝组织PKCε mRNA和蛋白含量均显著降低（P＜0.05），见表5、图3。

表3 各组大鼠血清血脂的含量比较（mmol/L，±s）

表3 各组大鼠血清血脂的含量比较（mmol/L，±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01。

0.46±0.20　0.27±0.76组别　n 10　0.68±0.63　0.24±0.19　0.34±0.23　0.60±0.36模型组　10　1.28±0.46b　0.42±0.08a　0.65±0.29a　0.38±0.05a苓桂术甘汤组　10　0.86±0.52　0.28±0.13c　0.48±0.35　0.33±0.14b茵陈蒿汤组　10　1.30±0.69　0.30±0.11c　0.59±0.29　0.50±0.22合方组　10　0.60±0.32d　0.26±0.85c　0.35±0.11c　0.29±0.13罗格列酮组　10　0.97±0.41　0.28±0.09cTC　TG　LDL　HDL空白组

图1 温运清利法对12周时大鼠肝组织石蜡切片苏木精-伊红染色的影响（×400）

图2 温运清利法对12周时大鼠肝组织石蜡切片油红O染色的影响（×100）

表4 各组大鼠肝组织DAG的比较（mmol/L，±s）

表4 各组大鼠肝组织DAG的比较（mmol/L，±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.05。

组别　n DAG空白组10　1.81±0.28模型组　10　2.66±0.23a苓桂术甘汤组　10　1.80±0.25b茵陈蒿汤组　10　1.90±0.22合方组　10　1.20±0.20b罗格列酮组　10　1.41±0.31c

表5 对肝组织PKCε mRNA和蛋白表达的影响（±s）

表5 对肝组织PKCε mRNA和蛋白表达的影响（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

组别　n　PKCε mRNA　PKCε蛋白空白组10　1.27±0.26　0.39±0.01模型组　10　2.47±0.38a　0.51±0.01a苓桂术甘汤组　10　1.60±0.97b　0.33±0.01c茵陈蒿汤组　10　1.64±0.00b　0.45±0.01b合方组　10　0.72±0.35c　0.26±0.01c罗格列酮组　10　0.51±0.13c　0.18±0.01c

图3 大鼠肝组织PKCε的Western blot的表达

2.5 对肝组织TNF-α mRNA和蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织 TNF-α mRNA和蛋白均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，茵陈蒿汤组、合方组及罗格列酮组大鼠肝组织TNF-α mRNA和蛋白含量显著降低（P＜0.05），苓桂术甘汤组大鼠也降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表6、图4。

表6 对肝组织TNF-α mRNA和蛋白表达的影响（±s）

表6 对肝组织TNF-α mRNA和蛋白表达的影响（±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

组别　n　TNFα mRNA　TNFα蛋白空白组10　0.85±0.12　1.16±0.12模型组　10　3.30±0.84a　2.19±0.24a苓桂术甘汤组　10　2.10±1.00　1.87±0.15茵陈蒿汤组　10　0.94±0.27b　1.58±0.21b合方组　10　0.62±0.32c　1.53±0.14b罗格列酮组　10　1.29±0.18b　1.66±0.19b

图4 大鼠肝组织TNF-α的Western blot的表达

3 讨论

胰岛素抵抗是NASH发病的重要机制之一［7］，几乎所有的NASH患者都存在周围组织和肝脏的IR。高脂饮食状态下，脂肪在肝脏大量蓄积，致使其对胰岛素的敏感性下降，从而发生IR，而IR又可反过来增加脂肪在肝细胞内蓄积，形成恶性循环。持续的脂肪蓄积会诱生炎症、氧化应激及脂质过氧化，从而造成肝脏的炎性损伤。因此，改善IR及炎症反应是防治NASH的关键。

DAG是甘油三酯和磷脂合成的中间物质，与NASH密切相关［8］。DAG含量的升高是NASH发生IR的一个重要标志，其与胰岛素敏感性的相关度达到64%，并与胰岛素抵抗指数呈显著正相关［8］。PKCε是DAG的靶蛋白，其被激活后，可下调胰岛素受体，抑制胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化［9］，从而引起胰岛素生物效应的减弱，影响胰岛素的信号传导，促进IR的发生。因此，DAG/PKCε信号通路的异常可引起脂质代谢紊乱和IR，是形成NASH的发病基础［8］。

DAG在肝细胞内大量合成并蓄积后，会引发肝细胞的脂肪变性，造成持续的肝脏损伤，从而引起TNF-α的过度分泌，其一方面通过降低胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化来加重IR，另一方面同时又直接损伤肝细胞，增加肝内ROS的产生，增强氧化应激及脂质过氧化反应，诱导肝细胞的炎症、坏死［10］，促进NASH的发生发展。

本次实验以高脂饲料诱导大鼠NASH模型，8周后可见大鼠体重及肝指数、血清生化指标等均明显升高，肝脏组织病理可见大量脂肪空泡及气球样变，证明模型构建成功。研究结果显示，模型组大鼠肝组织DAG、PKCε、TNF-α mRNA和蛋白均较正常组升高，提示DAG-PKCε通路参与了NASH的发生发展。而苓桂术甘汤组及含有苓桂术甘汤成分的合方组能显著降低肝组织DAG的含量，同时下调PKCε mRNA和蛋白的表达水平较茵陈蒿汤组明显，推测苓桂术甘汤在针对第一次打击的脂质代谢和IR发挥着更为重要的作用；而茵陈蒿汤组及含有茵陈蒿汤组能够显著下调TNF-α mRNA和蛋白的表达，推测茵陈蒿汤可能更针对第二次打击，而合方组的疗效均优于单用苓桂术甘汤组及茵陈蒿汤组。

本课题组认为，“痰浊内阻，湿热瘀结，肝体用失调”是NASH中医病机的关键，结合现代医学“二次打击学说”，痰浊内阻，阻滞气机，壅塞肝络，肝体用失调，病情较轻，是造成脂类物质在肝细胞内堆积，形成对肝脏“第一次打击”的发病基础；痰浊内阻，久郁化热，湿热瘀结，损伤肝络，肝体用失调，病情渐重，是致使脂肪酸氧化增强，进而出现氧应激和脂质过氧化的肝脏“第二次打击”的病理机制。因此创立温运清利法治疗NASH，以苓桂术甘汤着眼中焦，茵陈蒿汤擅入肝胆，两方合用，兼顾肝脾，既可运脾温化痰浊，又可清利肝胆郁积之湿热，温运清利并用，增强疗效。本研究的结果也证实，苓桂术甘汤和合方组针对第一次打击的IR，效果要优于茵陈蒿汤组；针对第二次打击之炎症损伤，茵陈蒿汤组及合方组要优于苓桂术甘汤组，而合方组又要优于单用苓桂术甘汤组及茵陈蒿汤组，由此可推测，苓桂术甘汤与茵陈蒿汤合方可同时针对引起NASH发病的二次打击，从而达到治疗NASH的目的。

本次研究通过动物实验探讨了DAG-PKCε信号通路对NASH大鼠的调控机制，对温运清利法治疗NASH的作用机制做了初步研究，进一步深化了NASH发病机制的认识。但本次研究仅是动物实验，DAG-PKCε信号通路能否促进人类NASH的发生发展，还有待今后进一步研究。

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（本文编辑：蒲晓田）

Experimental study of“Wenyun Qingli”method on DAG-PKCε signal pathway in liver tissue of NASH rats

MAO Tang-you，GAO Kang-li，ZHAO Wei-han，et al.Dongfang Hospital of Beijing
University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China

Li Jun-xiang；E-mail：lijunxiang1226@163.com

Objective To investigate the effect of Wenyun Qingli method on DAG-PKCε signal pathway in NASH rats.Methods High fat diet was used to induce NASH model on SD rats for 8 weeks. After 4 weeks of treatment，the automatic biochemical analyzer was used to measure the serum liver function （AST，ALT），blood lipid（TC，LDL，HDL，TG）level.HE staining and oil-red O staining method was used to observe the pathological changes of liver tissue，ELISA was used to detect the DAG of liver tissue，RT-PCR was used to detect the PKCε mRNA and TNF-α mRNA，Western blot was used to observe the expression of PKCε and TNF-α.Results （1）The mental state：general condition，liver index，inflammation and serum biochemical indices of treated groups were decreased compared with the model group；（2）The DAG levels of Linggui Zhugan decoction group，combination group，rosiglitazone group were decreased significantly compared with the model group（P＜0.05，P＜0.01）；（3）The PKC mRNA and protein content of treated groups were decreased significantly compared with the model group（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α mRNA and protein content in liver tissue of Yinchenhao decoction group，combination group，rosiglitazone group were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Wenyun Qingli method plays a role in protecting and treating NASH by down-regulating hepatic DAG and PKC expression，decreasing the levels of TNF alpha.DAG/PKCε pathway may be a new target for treating NASH.

WenyunQinglimethod； NASH； DAG-PKCεsignalpathway；Experimental study

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.002

高等学校博士学科点专项科研基金（20130013110007）；北京中医药大学自主选题项目（2015-JYBXS172）

100078 北京中医药大学东方医院脾胃肝胆科［毛堂友（博士研究生）、高康丽（硕士研究生）、赵唯含（博士研究生）、王允亮、郭一（博士研究生）、谢添弘（博士研究生）、陈晨（硕士研究生）、谭祥（硕士研究生）、韩亚飞（硕士研究生）、李军祥］

毛堂友（1989-），2014级在读博士研究生。研究方向：中医药防治胃肠疾病的研究。E-mail：maotangyouqun@126.com

李军祥（1964-），博士，主任医师，博士生导师。研究方向：中医药防治慢性肝胆和胃肠道疾病。E-mail：lijunxiang1226@163.com

（2016-02-26）