鸡肉冻干粉中妥曲珠利及妥曲珠利砜残留标准样品的研制

何　平，鞠玲燕，崔　嘉，李兆杰，宋晓华 ，杨丽君*

(1.中国合格评定国家认可中心，北京　100062；2.威海出入境检验检疫局，山东 　威海　264200)



鸡肉冻干粉中妥曲珠利及妥曲珠利砜残留标准样品的研制

何平1，鞠玲燕2，崔嘉2，李兆杰2，宋晓华2，杨丽君2*

(1.中国合格评定国家认可中心，北京100062；2.威海出入境检验检疫局，山东 威海264200)

建立了鸡肉冻干粉中妥曲珠利和妥曲珠利砜标准样品的研制和定值方法。通过口灌给药，使妥曲珠利在鸡体内代谢，从而使鸡肉中含有一定浓度的妥曲珠利和妥曲珠利砜，经均质、冷冻干燥、真空封装等处理后获得1批852个独立包装的鸡肉冻干粉标准样品。采用液相色谱-串联质谱对样品的均匀性和稳定性进行检测，通过8 家实验室协作定值的方式对标准样品进行定值和不确定度评估，最终确定妥曲珠利的标准值为(60.42±9.12) μg/kg，妥曲珠利砜的标准值为(73.10±12.48) μg/kg。结果表明样品的均匀性良好，稳定性长达24 个月，可用于鸡肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜残留分析的质量控制。

标准样品；鸡肉；妥曲珠利；妥曲珠利砜；研制；定值；液相色谱-串联质谱

标准样品(Reference material，RM)是一种或多种规定特性足够均匀和稳定的材料，已经确定其符合测定过程的预期用途(包括测量系统校准、测量程序评估、给其他材料赋值和质量控制)[1]。欧盟2002/657/EC中明确指出在兽药残留分析中需采用基体标准样品进行过程控制。但国外标准样品的价格昂贵而且订购和运输时间长，国内的残留分析实验室无法定期用其进行质控。我国兽药残留标准样品的研究起步较晚，虽有几家检验检疫机构开展了兽药残留检测实物标准样品的研究[2-6]，但仍未形成规模化、成品化的标准样品的制备、生产、供给。我国动物源兽药的标准样品相当匮乏，因此研制一系列均匀性和稳定性较好的动物源基体兽药标准样品具有广阔的应用前景。

妥曲珠利(Toltrazuil，TOL)是三嗪酮类抗球虫药物，因其高效、低毒、广谱的特点，被广泛用于畜禽养殖业中。妥曲珠利砜(Toltrazuril sulfone)是妥曲珠利的代谢产物。由于两者在仔鸡可食用组织中的残留时间很长，停药24 d后在鸡胸肌中仍能检出，因此，美国至20世纪末仍未批准该产品上市[7]。日本和欧盟规定鸡肉中妥曲珠利(以妥曲珠利砜计)的最大残留限量分别为0.9 mg/kg 和0.1 mg/kg[8]。目前，妥曲珠利和妥曲珠利砜的检测分析通常采用加标回收实验作为质量控制的手段，但加标回收率难以反映出真正阳性样品的提取效率，需采用妥曲珠利和妥曲珠利砜残留基体标准样品进行检测过程控制。本研究从给药到定值进行探讨，研制出含妥曲珠利和妥曲珠利砜残留的鸡肉冻干粉基体标准样品，填补了我国三嗪类药物残留基体标准样品的空白，并以能力验证计划为平台，将该基体标准样品应用于实验室外部质量控制过程。

1　实验部分

1.1实验动物与药物

实验用鸡购自本地养鸡场，选择当地成年肉鸡，雌雄各半，个体大小均一，体重约2.5 kg，适应饲喂7 d，给药前禁食12 h，自由饮水。实验用鸡经检测确认不含目标物后，取部分宰杀用作空白样品，其余进行给药实验，用于制备妥曲珠利和妥曲珠利砜标准样品。实验用药为市售妥曲珠利原药粉(含量≥98%，批号20120917)，购自湖北龙翔药业有限公司。

1.2试剂与仪器

甲醇(色谱纯，美国默克公司)；乙酸乙酯、环己烷(色谱纯，德国CNW公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，使用前需于650 ℃灼烧4 h，置于干燥器中备用。标准品：妥曲珠利(CAS：69004-03-1，纯度>98.0%)、妥曲珠利砜(CAS：69004-04-2，纯度>99.0%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，内标妥曲珠利-D3(CAS：1353867-75-0，纯度>98.0%)购自德国Witega公司。

Ultimate 3000高效液相色谱仪、TSQ Vantage串联四极杆质谱仪(美国Thermofisher公司)；CR22GⅡ高速冷冻离心机(日立公司)；Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；MS3旋涡混合器(德国IKA公司)；B20-KT高速多功能搅拌机(广东恒联食品机械有限公司)；8411型电动振筛机(上海宝兰实验仪器有限公司)；YB-1000A型高速中药粉碎机(上海力箭机械有限公司)；UM44A型粉碎混匀机(德国Stephan公司)；4 kg×25盘冷冻干燥仓(威海众合食品有限公司)；VS-600WA真空包装机(深圳市晟枫包装机械有限公司)。

1.3分析方法

1.3.1样品的前处理称取鸡肉5 g或鸡肉粉1 g(鸡肉粉需加4倍样品质量的水还原60 min)，精确至0.01 g，加入内标溶液、25 mL乙酸乙酯和5 g无水硫酸钠，10 000 r/min均质提取1 min，离心，取10 mL提取液于玻璃管中，45 ℃下氮气吹干，用乙酸乙酯-环己烷(50∶50)溶解残渣并定容至10 mL，GPC净化后，将收集的洗脱液蒸干，用1 mL甲醇-水(8∶2)溶解残渣，涡旋振荡，过0.45 μm有机滤膜，供LC-MS/MS检测。

1.3.2液相色谱条件色谱柱：Kinetex XB-C18(2.6 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为0.1%甲酸溶液；B为乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱条件：0～2.0 min，30%～55%B，2.0～8.5 min,55%B，8.5～8.7 min，55%～90%B，8.7～11.0 min，90%B，11.0～11.1 min，90%～30%B，11.1～15 min，30%B。

1.3.3质谱条件电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)；选择反应监测模式(SRM)；电喷雾电压:3 200 V；离子传输毛细管温度:350 ℃；加热器温度:350 ℃；鞘气压力:40 arb；辅助气压力:10 arb；妥曲珠利的监测离子m/z424.0，碰撞能量(CE)为3 V，S-lens RF电压为81 V；妥曲珠利砜的监测离子m/z456.0，碰撞能量(CE)为5 V，S-lens RF电压为:94 V；妥曲珠利-D3的监测离子m/z427.0，碰撞能量(CE)为3 V，S-lens RF电压为81 V。

1.4标准样品的制备

妥曲珠利按照每只鸡0.2 mg的药量，药粉装入胶囊中，将胶囊塞至鸡舌根处，让鸡自然咽下，每天给药1次，连续给药3 d，停药后每10 h宰杀进行检测，直至得到鸡肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜的含量约为15 μg/kg，宰杀后取鸡胸肉和鸡腿肉，洗净血水。按4∶1的比例加水将鸡肉混匀制成肉糜，将肉糜放入真空冷冻干燥机内，-70 ℃速冻成厚度不超过2 cm的冻块，置于真空干燥仓中，保持48 h，直至冻块干燥。将冷冻干燥后的肉糜取出，用高速中药粉碎机粉碎、匀质后的肉粉过60目孔筛，弃去筛余粗粉；聚乙烯瓶提前45 ℃烘干，放入无菌室用紫外灯灭菌，在无菌室内准确称量干粉置于聚乙烯瓶中，每个瓶内鸡粉的质量6.0 g，再用铝箔袋将包装瓶真空封装，随机在外包装顺序编号，共计852瓶；-18 ℃冷冻保存，进一步做均匀性和稳定性检测。

1.5均匀性研究

标准样品的特性应当均匀，即在规定的细分范围内保证其特性不变。本文研制的标准样品数量在500瓶以上，根据以往的研制经验，均匀性相对较好，故均匀性检验方案设计为每种随机抽取15瓶，每瓶样品中各抽取3份子样，在相同的实验条件下对标准样品进行均匀性检测，采用单因素方差分析法对样品的均匀性数据进行处理，判断标准样品是否均匀[9-10]。

1.6稳定性研究

稳定性研究是为了确定标准样品稳定贮存和运输的环境条件。在适宜的环境条件下，标准样品特性值应不会随着贮存、运输时间的延长发生显著变化。对于新研制的标准样品，首先应考察其在给定贮存条件下的长期稳定性。当标准样品稳定贮存条件与标准样品应用时的实际运输条件存在较大差异时，还应考察该标准样品在运输过程中的短期稳定性[9-11]。

1.6.1短期稳定性短期稳定性研究是确定标准样品运输的环境条件。短期稳定性实验进行30 d，按先密后疏选6个时间点(0，2，5，9，14，30 d)，模拟运输中遇到的极端温度(-18，25，50 ℃ 3个温度点)存放，每次测量随机选择3瓶，每瓶样品平行分析2次，共6组数据，以3瓶的总平均值为该时间点的特性值稳定性检验结果。

1.6.2长期稳定性长期稳定性研究是确定标准样品稳定贮存的环境条件。时间间隔分别为0，3，6，12，18，24个月，具体方案是在每个稳定性检验时间点从库存样品中随机抽取3瓶样品，每瓶样品平行分析2次，共6组数据，以3瓶的总平均值为该时间点的特性值稳定性检验结果。

1.7定值与不确定性评估

本标准样品的定值采用8个有较高权威性的实验室协作定值的方式进行，每个实验室3个样品，每个样品做2个平行，测定数据经过格拉布斯(Grubb's)检验、夏皮罗-威尔克(Shapiro-wilk)检验、狄克逊(Dixon)检验、科克伦(Cochran)检验后取平均结果定值。标准样品特性值的不确定度由协作定值产生的不确定度，长期稳定性和短期稳定性产生的不确定度，以及瓶间不均匀性产生的不确定度合成并扩展(包含因子k=3)而得。

图1　给药后鸡肉中妥曲珠利和妥曲珠利砜 的含量与时间曲线Fig.1　Time-concentration curves of toltrazuil and toltrazuil sulfone in chicken muscle after oral administration

2　结果与讨论

2.1样品的制备

为了保证精确给药，本研究选择口腔灌服给药的方式。家禽内服妥曲珠利后，迅速被代谢为妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜，但一次给药很难将鸡肉组织中两种药物的水平控制在同一数量级内，因此采用连续3 d给药方式[6]，给药后监测鸡肉组织中妥曲珠利和妥曲珠利砜的浓度(见图1)，选择适宜浓度时宰杀。结果表明，停药10 h时，肌肉组织中的部分妥曲珠利代谢为妥曲珠利砜，在此时取样，鸡肉组织中妥曲珠利和妥曲珠利砜的残留量接近，约为15.0 μg/kg，此后妥曲珠利继续代谢，肌肉组织中妥曲珠利砜的含量增加，而妥曲珠利含量逐渐消减。

宰杀后取样，要求尽量避免血液与肌肉接触，采用不易受血液污染的鸡胸肉和鸡腿肉，且匀浆、粉碎、过筛和冷冻干燥等过程应严格控制，保证最后制得样品的均一性。例如在冻干器壁上鸡肉的涂抹厚度要适中，厚度过厚，会使冻干时间延长，而且冻块会出现局部板结化，造成冻干不均匀。分装前，分散取六点，进行均匀性初测，均匀性满足要求后，进行无菌分装。

2.2样品的测定

按前述分析方法处理样品后，得到妥曲珠利和妥曲珠利砜标准品以及鸡肉冻干粉标准样品的MRM色谱图(如图 2)。 由图可见标准样品中妥曲珠利、妥曲珠利砜以及同位素内标与样品中各组分良好分离，且出峰保留时间和对应的各组分保留时间基本一致,标准样品的目标检测物出峰处无杂峰干扰，证明所获取的标准样品中存在目标检测物，且能准确反映样本中目标物的残留量。

　

　图2　妥曲珠利和妥曲珠利砜标准品(A)以及鸡肉冻干粉标准样品(B)的SRM色谱图Fig.2　SRM chromatograms of toltrazuil and toltrazuil sulfone standards(A)and the reference materials in chicken muscle lyophilisates(B)

2.3均匀性研究

在均匀性检验过程中，一般需同时考察组间均匀性及组内均匀性，本研究采用单因素方差分析法对样品的均匀性数据进行处理[9-11]，结果如表1所示。根据方差分析原理，该统计量是自由度为(v1，v2)的F分布变量。由公式v1=m-1，v2=N-m，并已知m=15，N=3×15=45；则v1=14，v2=30，在显著性水平α=0.05时，计算得F0.05(14,30)=1.367和1.607，查表得到F临界值(Fcrit)=2.04，F值小于Fcrit值时，该样品均匀，并将样品的不均匀性误差计入总的不确定度。

表1　妥曲珠利和妥曲珠利砜标准样品的均匀性检验(n=3)

(续表1)

No.ToltrazuilToltrazuilsulfoneDetected/(μg·kg-1)Average/(μg·kg-1)Detected/(μg·kg-1)Average/(μg·kg-1)1259.82,58.19,56.8458.2875.90,79.95,74.9676.941358.89,61.01,62.8260.9179.83,80.83,81.5880.751458.31,56.42,59.6958.1479.88,77.42,78.9078.731562.33,61.16,63.0962.1979.67,81.72,79.2480.21P-value0.2770.186F0.05(14,30)1.3671.607Fcrit2.0372.037

2.4稳定性研究

标准样品稳定性研究的基本模型是Y=β0+β1X+ε，用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以X代表时间，Y代表标准样品中目标物的含量，ε代表随机误差分量，采用t检验法对样品的稳定性数据进行处理，比较t检验计算值(tcal)与t检验临界值(tcrit)，tcal≤tcrit时，表明标准样品是稳定的[9-11]。短期稳定性数据见表2，可以看出，tcal

表2　妥曲珠利和妥曲珠利砜短期稳定性研究的数据(n=2)

表3　妥曲珠利和妥曲珠利砜的长期稳定性研究数据(n=6)

2.5定值与不确定度评定

表4　各定值实验室的妥曲珠利测定数据处理结果

表5　各定值实验室的妥曲珠利砜测定数据处理结果

2.5.2不确定度评估以全部定值实验室的测定结果为整体进行定值不确定度评估，考虑长期稳定性和短期稳定性以及样本之间的不均匀性产生的不确定度，在数据检验满足要求的前提下，不再单独评估单个实验室人员操作、仪器设备等产生的不确定度，以简化不确定度的评估量，同时保证评估数据的可靠性。分析不确定度评估结果，本标准样品的不确定度来源主要有以下方面[10，12-15]：

①标准样品协作定值产生的不确定度：包括检测方法、样品前处理、环境设施、人员操作、仪器差异等产生的不确定度。uchar=s/n0.5，s为总均值标准偏差，n为实验室数。

③短期稳定性产生的不确定度：即标准样品在各种运输环境下的不稳定所产生的不确定度。usts=s(b1)×t,t为短期稳定性检验持续的时间，s(b1)为斜率标准偏差的估计值。

在置信概率为99%时，k=3，则标准样品的扩展不确定度为:U=kuc，不确定度结果见表6。

表6　妥曲珠利和妥曲珠利砜标准样品的不确定度

最终确定妥曲珠利标准值为(60.42±9.12) μg/kg，妥曲珠利砜标准值为(73.10±12.48) μg/kg。

图3　实验室Z值分布图Fig.3　Histogram of Z-scores of labs

2.6应用

应用本标准样品成功组织了12个实验室参与的CNAS T0785“鸡肉中地克珠利、妥曲珠利和妥曲珠利砜残留量的测定”能力验证。以各参加实验室检测结果的Z比分数(Z值)作为评价其结果满意度的依据，Z值的大小代表实验室的结果与中位值的偏离程度，∣Z∣≤2.0为满意结果，2.0<∣Z∣<3.0为可疑结果，∣Z∣≥3.0为不满意结果。Z值分布的原理实际上是呈正态分布的显著性检验，本次能力验证的Z值分布见图3。由图3可见，本次能力验证的数据服从正态分布，测试结果较为集中，无较大偏差。参加能力验证实验室对妥曲珠利测定结果的平均值为57.6 μg/kg，妥曲珠利砜测定结果的平均值为64.0 μg/kg，在标准样品最终确定的标准值(妥曲珠利60.42±9.12 μg/kg、妥曲珠利砜73.10±12.48 μg/kg)范围内。

3　结　论

通过药物饲养试验动物，确定最佳的饲养条件和采集时机，获得了预期含量的代表实际样品原状态的含妥曲珠利和妥曲珠利砜的鸡肉冻干粉标准样品。该标准样品适用于妥曲珠利和妥曲珠利砜残留分析质量控制，填补了我国抗球虫类兽药基体标准样品的空白，对进一步开展各类残留检测用基体标准样品的研制工作具有重要意义。

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Preparation and Certification of Reference Materials for Toltrazuil and Toltrazuil Sulfone in Chicken Lyophilisates

HE Ping1，JU Ling-yan2，CUI Jia2，LI Zhao-jie2，SONG Xiao-hua2，YANG Li-jun2*

(1.China National Accreditation Service for Conformity Assessment,Beijing100062,China；2.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai264200,China)

A method for preparing and certifying the reference materials of toltrazuil and toltrazuil sulfone in chicken muscle lyophilisates was presented.Toltrazuil was accessed to chicken by oral administration.With the metabolism of toltrazuil in chiken,a certain concentration of toltrazuil and toltrazuil sulfone were obtained in the muscles.Lyophilization of the muscles was performed in one batch,and 852 bags of samples were obtained by the procedure of homogenation，cryodesiccation and vacuum-packaging.The homogeneity and stability of the sample were examined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The value of the chemical constituent of the sample was certified through the collaborative analysis program participated by 8 laboratories,and the uncertainty was evaluated.The standard values of standard samples were certified as(60.42±9.12)μg/kg for toltrazuil and (73.10±12.48)μg/kg for toltrazuil sulfone.The results showed that good homogeneity and stability of the sample reached up to 24 months,and could be used for the quality control of toltrazuil and toltrazuil sulfone residue in chicken.

reference materials; chicken; toltrazuil; toltrazuil sulfone;preparation;certification；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2015-11-23；

2016-01-07

质检公益性行业科研专项(201310143)

杨丽君，硕士，高级工程师，研究方向：食品安全,Tel:0631-3807680，E-mail:yihan82527@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.006

O657.7;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0811-08