在线固相萃取/高效液相色谱法检测熏烤鱼及熏烤肉制品中的多环芳烃

王春蕾，蒋树新，刘华良，马永建*，阮　华，韦广丰

(1.东南大学　公共卫生学院，江苏　南京　210009；2.江苏省疾病预防控制中心，江苏　南京　210009；3.江苏辉丰农化股份有限司，江苏　盐城　224100)



在线固相萃取/高效液相色谱法检测熏烤鱼及熏烤肉制品中的多环芳烃

王春蕾1,2，蒋树新1,2，刘华良2，马永建1,2*，阮华3，韦广丰3

(1.东南大学公共卫生学院，江苏南京210009；2.江苏省疾病预防控制中心，江苏南京210009；3.江苏辉丰农化股份有限司，江苏盐城224100)

基于在线净化富集技术，建立了熏烤鱼和熏烤肉制品中15种欧盟优控多环芳烃的在线固相萃取/高效液相色谱-紫外/荧光(Online-SPE/HPLC-UV/FLD)检测方法。对提取溶剂和流动相进行优化，样品采用乙腈-丙酮(6∶4)匀浆处理，超声提取后，在线固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm)净化富集，反相C18PAH专用柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)分离，水、乙腈和异丙醇梯度洗脱，紫外和荧光检测器检测。结果表明，15种多环芳烃在相应的浓度范围内线性良好(r2>0.999)；检出限为0.03～8.33 μg/kg；熏烤鱼的回收率为67.4%～107.2%，相对标准偏差(RSD)为0.2%～7.7%；熏烤肉的回收率为71.8%～110.5%，RSD为0.8%～8.9%。经FAPAS质控样品验证，所测化合物种类和浓度范围均满足要求。

在线固相萃取；多环芳烃；高效液相色谱；熏烤鱼；熏烤肉

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环结构的持久性有机污染物(Persistent organic pollutants，POPs)，部分PAHs具有遗传毒性、致癌性或潜在致癌性，严重威胁人体健康，因此已被欧盟(EU)和美国环境保护署(EPA)列为优先控制污染物，欧盟优控PAHs比EPA优控PAHs包含更多5～6环的毒性更大的重质PAHs[1-3]。环境污染和高温处理的食品加工工艺会将PAHs引入食品。熏烤是最古老的食品加工工艺之一，距今已有千年历史，因其有脱水 、杀菌和抗氧化的功能，最初是用来加强食物的保存[4-5]。熏烤鱼和熏烤肉及其制品在熏烤过程中可产生吸引感官的活性物质(主要是酚类、有机酸和内酯等)，带来独特的风味、色泽和芳香，因此深受消费者青睐[6]。但熏烤过程中木炭的不完全燃烧和有机物(如脂类、蛋白质和碳水化合物等)热解会产生副产物——PAHs，而PAHs具有亲脂性，易蓄积在脂肪组织内[7-8]。鉴于熏烤鱼和熏烤肉及其制品日益成为膳食中重要的组成部分，监测此类食品中PAHs的含量显得尤为重要。

1　实验部分

1.1仪器、试剂与材料

UltiMate 3000高效液相色谱系统(美国Thermo公司)；高速匀浆机、涡旋振荡器(德国IKA公司)；高速冷冻离心机、分析天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)。

1.2实验条件

1.2.1提取称取熏烤鱼或熏烤肉样品2.0 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 g无水硫酸钠和10 mL乙腈-丙酮(6∶4)，匀浆处理10 min，超声提取15 min后于5 000 r/min离心5 min，取上层清液，残渣用10 mL乙腈-丙酮(6∶4)再提取1次，合并提取液，准确移取10 mL提取液于试管中，氮吹后用0.5 mL IPA复溶，10 000 r/min离心5 min后转移至进样瓶中，待测。

1.2.2色谱条件在线固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm，7 μm，Agilent公司)，分析柱C18PAH专用柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司)，柱温28 ℃，进样盘温度30 ℃，进样量20 μL，萃取柱的流动相为水(溶剂A)、乙腈(溶剂B)和异丙醇(溶剂C)，具体洗脱程序见表1，前7 min为上样萃取阶段，7～30 min为转移阶段，30 min后是萃取柱的清洗平衡阶段，待下次进样，分别在7 min和30 min处进行六通阀的切换。分析柱的流动相为乙腈(溶剂B)和水(溶剂A)，采用梯度洗脱，具体洗脱程序见表1。

表1　萃取柱洗脱程序

2　结果与讨论

2.1提取条件的优化

检测熏烤鱼和肉类样品中PAHs的难点在于样品中PAHs含量低，且基质复杂，干扰严重，尤其是脂肪组分[16]。考察了匀浆对提取效果的影响，比较了不匀浆和匀浆后的回收率，结果表明：匀浆后的提取效率显著增加。这是由于匀浆可以打碎机体组织，释放组织内部的PAHs。通过查阅文献和相关国家标准[14,17-18]，比较了环己烷、正己烷-丙酮(1∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)、环己烷-乙酸乙酯(1∶1)和乙腈-丙酮(6∶4) 5种溶剂的提取效率(见图1)。结果表明，乙腈-丙酮(6∶4)的提取效果最佳，回收率为77.4%～128.6%，并且采用乙腈-丙酮匀浆后匀浆机转头上基本无残留，而其余4种溶剂匀浆后转头上均有较多残留，可能是这些溶剂回收率低的原因之一。同时比较了超声提取次数的影响，发现提取2次的结果优于提取1次。优化的提取条件见“1.2.1”。

2.2色谱条件的优化

在线萃取采用ChromSpher Pi柱，运用供体与受体结合的原理进行在线净化，Waters公司的C18PAH专用柱进行分离。参考文献[19]，用100% IPA小流速上样，去除基质中残留的脂肪酸和色素物质，上样结束后切换六通阀，用ACN-H2O去除多余的IPA，过渡到分析柱的洗脱条件，以ACN-H2O梯度洗脱。采用小体积上样，由于基质是熏烤鱼或烤肉，经简单提取，复溶后的样品中仍存在部分油脂成分，但不如油样粘稠，可适当降低柱温和进样盘温度，进样盘温度降为30 ℃，柱温降为28 ℃，并增加一根预柱，以增加峰与峰的分离度，延长分析柱的寿命，同时优化了洗脱梯度和流速。目前国际上较为普遍的说法是15+1种欧盟优控多环芳烃，增加的物质是苯并(c)芴(BCF)，本次研究发现BCF的最优激发和发射波长较为普通，并且保留时间在六通阀切换前后，干扰较强，无法准确定量，故本研究未将其纳为检测对象。采用单通道FLD检测14种荧光物质，分时间段切换波长，具体见表2。所得14种荧光PAHs的色谱图见图2。无荧光性的CPP采用UV检测器进行检测，波长设置为220 nm(见图3)。

2.3方法学验证

在优化条件下，以浓度值为横坐标，平均峰面积为纵坐标绘制标准曲线，对15种化合物标准溶液的线性范围进行考察。结果显示，除CPP的浓度范围为50～1 000 ng/mL外，其余14种PAHs在1～100 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(r2)大于0.999。在实际熏烤样品中进行3个水平加标回收实验，平均相对标准偏差(RSD)和平均回收率见表3。熏烤鱼的回收率为67.4%～107.2%，RSD为0.2%～7.7%；熏烤肉的回收率为71.8%～110.5%，RSD为0.8%～8.9%。实验结果显示，熏烤肉类的回收率普遍高于熏烤鱼，有研究表明PAHs易扩散，会根据浓度梯度进入组织细胞内部[16]，可能是熏烤鱼组织细胞在匀浆过程中未被完全打碎导致回收率略低。根据3倍信噪比(S/N)以及10倍S/N分别确定各化合物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ),CPP无荧光性，因此采用UV检测器检测。各化合物的LOD为0.03～8.33 μg/kg，LOQ为0.09～25.00 μg/kg(表3)。

表3　方法学验证结果

(续表3)

2.4质控样品的检测

采用本方法检测FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)质控熏烤鱼样品(T0659QC)，可测得6种目标PAHs，测定结果均在可接受范围内，说明本方法具有良好的准确性，结果见表4。

表4T0659QC样品的检测结果

Table 4Results of quality control sample(T0659QC)w/(μg·kg-1)

*：the sum of BAA,CHR,BBF and BAP

2.5实际样品检测

采用本方法检测南京市售6种熏烤鱼和熏烤肉(S1～S6)中欧盟优控15种PAHs的含量，结果见表5。实际样品中检出的BAP含量为 0.11～0.26 μg/kg，4种PAHs含量之和为0.74～1.05 μg /kg，含量较低，均满足我国和欧盟的限量标准。其中CHR，SMC，BBF，BKF，BAP和BGP在所有样品中均检出。

表5样品中15种PAHs的含量

Table 5PAHs contents in samples Table 5PAHs contents in samplesw/(μg·kg-1)

(续表5)

*no detected;**:the sum of BAA,CHR,BBF and BAP

3　结　论

本文建立了在线净化富集技术检测熏烤鱼和熏烤肉中15种欧盟优控多环芳烃的分析方法。通过优化在线萃取和分析条件，实现了15种目标物的有效分离，简化了实验步骤，且方法重现性好，可以满足我国和国际上对PAHs定量分析的要求。但实验发现匀浆过程并不能保证将机体的组织细胞完全打碎，部分PAHs仍残留在细胞内，在今后的研究中将更深入地探讨匀浆处理条件，或者尝试新的匀浆技术。

[1]SCF，Scientific Committee on Food，Opinion of the Scientific Committee on Food on the Risks to Human Health of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food.4 December 2002.European Commission(EC)，Brussels，2002.

[2]Essumang D K,Dodoo D K,Adjei J K.J.FoodCompos.Anal.,2012,27:128-138.

[3]Duedahl-Olesen L,Aaslyng M,Meinert L,Christensen T,Jensen A H,Binderup M L.FoodControl,2015，57:169-176.

[4]Suranová M,Semanová J,Skláršová B,Simko P.FoodAnal.Methods,2015，8:1014-1020.

[5]Essumang D K,Dodoo D K,Adjei J K.FoodChem.Toxicol.,2013，58:86-94.

[6]Ledesma E,Rendueles M,Díaz M.FoodAddit.Contam.A,2014,31(10):1688-1698.

[7]Chen Y C,Shen G F,Su S,Shen H Z,Huang Y,Li T C,Li W,Zhang Y Y,Lu Y,Chen H,Yang C L,Lin N,Zhu Y,Fu X F,Liu W X,Wang X L,Tao S.Environ.Sci.Pollut.Res.,2014,21:11521-11530.

[8]Chen S,Kao T H,Chen C J,Huang C E,Chen B H.J.Agric.FoodChem.,2013，61:7645-7653.

[9]GB2762-2012.Maximum Levels for Contaminants in Food.National Standards of the People's Republic of China(食品中污染物限量.中华人民共和国国家标准).

[10]Commission Regulation(EU) No 835/2011.Amending Regulation(EC) No 1881/2006 as Regards Maximum Levels for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Foodstuffs.Official Journal of the European Union，2011.

[11]Ghasemzadeh-Mohammadi V,Mohammadi A,Hashemi M,Khaksar R,Haratian P.J.Chromatogr.A,2012,1237:30-36.

[12]Lund M,Duedahl-Olesen L,Christensen J H.Talanta,2009，79:10-15.

[13]Jira W.Eur.FoodRes.Technol.,2010，230:447-455.

[14]Zhu L,Yang R,Ma Y J,Liu H L.J.FoodSaf.Qual.(朱琳，杨润，马永建，刘华良.食品安全质量检测学报)，2013，4(3):911-916.

[15]Liu W,Qi J R,Yan L N,Jia Q,Yu C.J.Chromatogr.B,2011,879:3012-3016.

[17]GB23213-2008.Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Vegetable Oils——GC-MS Method.National Standards of the People's Republic of China(植物油中多环芳烃的测定 气相色谱-质谱法.中华人民共和国国家标准).[18]Zhang X L,Liu Y,Ma L,Wang K Q,Yue F,Wang J D.J.Anal.Sci.(张旭龙，刘银，马玲，王宽强，岳凡，王吉德.分析科学学报)，2013，29(6):763-767.

[19]Wang C L,Liu H L,Ma Y J,Ruan L P.Chin.J.Anal.Chem.( 王春蕾，刘华良，马永建，阮立萍.分析化学)，2015，43(11):1743-1748.

Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Smoked Fish and Smoked Meat by Online Solid-phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography

WANG Chun-lei1,2，JIANG Shu-xin1,2，LIU Hua-liang2，MA Yong-jian1,2*，RUAN Hua3，WEI Guang-feng3

(1.School of Public Health，Southeast University，Nanjing210009，China;2.Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing210009，China;3.Jiangsu Huifeng Agrochemical Company Limited，Yancheng224100，China)

Based on on-line purification-enrichment technology，a novel method was developed for the determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked fish and smoked meat by online solid-phase extraction and high performance liquid chromatography with ultraviolet/fluorescence detection(online-SPE/HPLC-UV/FL-D).Experimental parameters such as extraction solvent and mobile phase were optimized.The homogenized smoked samples were dissolved with acetonitrile-acetone(6∶4),and then extracted ultrasonically.The online purification-enrichment was performed on a solid-phase extraction ChromSpher Pi column(80 mm×3 mm),and the separation was carried out on a C18reversed-phase PAH column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm) using ultraviolet detection at 220 nm and fluorescence detection.Isopropyl alcohol，acetonitrile and water were served as mobile phases by gradient elution.The results showed that good linearities for 15 polycyclic aromatic hydrocarbons existd in corresponding concentration ranges with correlation coefficients(r2) more than 0.999.The limits of detection(LODs) were between 0.03 μg/kg and 8.33 μg/kg.The recoveries of 15 components at three spiked levels in smoked fish samples were in the range of 67.4%-107.2% with relative standard deviations(RSD，n=6) of 0.2%-7.7%.The recoveries of 15 components at three spiked levels in smoked meat samples were in the range of 71.8%-110.5% with relative standard deviations(RSD，n=6) of 0.8%-8.9%.Verified by FAPAS quality control samples,the types and concentration ranges of analytes could meet the requirements.

online solid-phase extraction(online SPE)；polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)；high performance liquid chromatography(HPLC);smoked fish;smoked meat

2015-12-02；

2015-12-29

江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(SJLX_0110)；江苏省“十二·五”科教兴卫工程(ZX201109)

马永建，硕士，主任技师，研究方向：分析化学，Tel：18915999468，E-mail：mayongjian@jscdc.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.005

O657.72;O625.15

A

1004-4957(2016)07-0805-06