不同禽流感病毒含量的新-流二联灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平的监测

江兴华　赵华娥　林晓荣　包松英　崔龙萍　王全溪

（1.福州大北农生物技术有限公司　福州　350014；2.福建农林大学动物科学学院　福州　350002）

不同禽流感病毒含量的新-流二联灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平的监测

江兴华1赵华娥1林晓荣1包松英1崔龙萍1王全溪2*

（1.福州大北农生物技术有限公司福州350014；2.福建农林大学动物科学学院福州350002）

将未浓缩的新城疫抗原分别与未浓缩的、浓缩3倍、浓缩6倍的禽流感抗原混合，并制备成三组鸡新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗（简称新-流二联灭活疫苗），分别免疫21日龄SPF鸡，每羽0.3 mL，同时设置未免疫的空白对照组，免疫组与对照组均在免疫前及免疫后7、14、21、28、35 d进行采血，检测新城疫和禽流感抗体。结果发现，各免疫组在免后不同日龄的新城疫抗体基本一致，禽流感病毒抗原浓缩倍数越高（即禽流感病毒含量越高）的新-流二联灭活疫苗，免后14、21 d的抗体也越高；从免后21 d开始，各免疫组的禽流感抗体水平差异逐渐减小，免疫后禽流感抗体水平的高低可以反映该疫苗的免疫效果。试验结果表明，该疫苗可以通过浓缩提高抗原病毒含量的方法来提高免后早期抗体水平，取得良好的早期免疫效果。

新城疫禽流感不同病毒含量二联灭活疫苗SPF鸡抗体水平监测

鸡新城疫是由新城疫病毒引起的一种烈性病毒性传染病，禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种禽的急性、接触性、烈性传染病［1］，两种疫病均是影响养禽业发展的主要疾病。在我国，低致病性禽流感以H9N2亚型为主型，流行范围广，占禽流感阳性鸡群总数的93.6%［2］；H9N2亚型禽流感传播能力强，感染发病率高，可造成鸡群产蛋下降及严重影响肉鸡生长速度，与其他病原共同感染导致高死亡率，给养禽业带来巨大的经济损失［3-5］。疫苗免疫是防止新城疫、禽流感暴发和造成巨大损失的主动措施、关键环节和最后防线［6］。因此，研制安全有效的疫苗，对鸡群进行免疫接种，使鸡群产生免疫力，以保护鸡群免受新城疫、禽流感的侵害是我国畜牧业发展的迫切需要，是防控新城疫、禽流感的当务之急［7］。目前市场上的新-流疫苗质量不一、免疫效果差别较大。众所周知，影响疫苗免疫效果的因素很多，抗原病毒含量的高低是其中一项重要影响因素。本研究通过浓缩的方法制备不同流感病毒含量组别的鸡新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗，监测不同组别疫苗免后的抗体水平，观察二联灭活疫苗的使用效果，从而为制备具有更好免疫效果的新城疫、禽流感二联灭活疫苗提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用抗原福州大北农生物技术有限公司生产的未浓缩的新城疫抗原、不同浓缩倍数的流感抗原。

1.1.2试验用疫苗鸡新城疫、禽流感 （H9N2 HP株）二联灭活疫苗由福州大北农生物技术有限公司用试验抗原乳化而成，批号：SY2015003。

1.1.3试验用鸡21日龄SPF鸡40羽。SPF蛋由济南斯帕法斯家禽有限公司提供，福州大北农生物技术有限公司自行孵化。

1.2试验方法

1.2.1疫苗的制备使用生产中的新城疫和禽流感抗原，新城疫抗原为收获的未浓缩的抗原，禽流感抗原为收获的未浓缩的抗原、进行3倍浓缩的抗原、进行6倍浓缩的抗原。将新城疫抗原与各组禽流感抗原加入4%吐温作为水相，按水相与油相比为1：3的比例，使用试验型高速剪切机，将水相加入油相中进行剪切、乳化制成油包水剂型的单苗，然后将新城疫单苗与各组禽流感单苗等量混合均匀作为不同组的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗；流感抗原未浓缩的疫苗样品为A组，流感抗原3倍浓缩的疫苗样品为B组，流感抗原6倍浓缩的疫苗样品为C组。

1.2.2试验分组SPF蛋进行孵化，出壳的雏鸡由本公司自行养至21日龄。选择健康有活力的鸡40羽，随机选10羽编为A组，免疫A组疫苗样品；随机选10羽编为B组，免疫B组疫苗样品；随机选10羽编为C组，免疫C组疫苗样品；余10羽编为D组，为空白对照组。并对每羽鸡打上翅标编号，试验鸡在免前、免后均在隔离器内喂养。

1.2.3免疫方法分别将A、B、C组新-流二联灭活疫苗样品免疫21日龄SPF鸡，每羽颈部皮下注射0.3 mL；空白对照组均不免疫。

1.2.4抗体监测各免疫组与对照组均于20日龄（即免前）及免后7、14、21、28、35 d进行采血，检测新城疫与禽流感抗体。

1.2.5抗体检测方法抗体检测应用红细胞凝集抑制试验的方法，具体步聚：用PBS将待检血清做2倍系列稀释，加入含4HAU血凝素抗原液，并设PBS 和4HAU血凝素抗原液对照，充分振摇后，置室温下至少20 min或在2～8℃下40～60 min，再加入1%鸡红细胞悬液，置室温20～40 min或置2～8℃ 下40～60 min，当红细胞对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。

2　结　果

从新城疫、禽流感抗体监测结果可以看出（见表1、图1-图2），对照组新城疫、禽流感抗体在各日龄均为阴性，免疫组新城疫、禽流感抗体均从免后7 d开始迅速上升，免后21 d上升至峰值，然后开始逐渐下降。由于各免疫组疫苗的新城疫抗原含量一样，所以，免后各时间的抗体基本一致。而不同组的流感抗原含量不一样，免后14 d、21 d的抗体有较大的差别，浓缩倍数越高，两个时间段的抗体值越高；免后28 d及以后，各组流感抗体又非常接近。

表1　新城疫、禽流感抗体水平监测结果

3　结论与讨论

1）目前市场上对新城疫、禽流感疫苗的免疫效果评价不一，与各厂家疫苗的质量有一定的关系。各厂家疫苗中所含的抗原病毒含量有较大的差异，有的厂家抗原效价低，有的抗原效价高，部分厂家的抗原进行了不同倍数的浓缩。本试验免疫不同浓缩倍数流感抗原制备的疫苗后，抗体水平结果可以反映不同组疫苗免疫效果的确有一定的差别。在郑世兰等［8］的研究中提到，提高单位体积的抗原含量是联苗生产的技术关键，而抗原浓缩是达到此目的的理想办法；在张健等［9］的研究也说明这一点，生产鸡用联苗尤其是生产四联苗，单位体积内抗原含量是关键，而单纯改变疫苗乳化工艺中的油水比例以及通过改变病毒增殖条件均不能达到多联苗生产所需要的抗原含量。因此，寻求一种抗原浓缩的方法使每羽份疫苗中含有足够的抗原，同时使免疫剂量尽量减小，是四联苗生产中的重要一环。还有一些关于不同免疫剂量的免疫效果的研究也同样说明疫苗中抗原病毒含量的重要性，如温志芬等［10］研究结果显示，0.5 mL/羽剂量的免疫效果比0.1 mL/羽和0.3 mL/羽剂量的免疫效果好，免疫剂量大表明注射到机体中的抗原含量也相对多，免疫效果更好。

2）新城疫、禽流感抗体的产生与抗原毒价（病毒含量）呈正相关，抗原毒价越高，抗体产生水平越高，持续期长［11］。因此，在生产中提升疫苗中的抗原病毒含量是关键，作为疫苗厂家可以通过不同的方法提升抗原的病毒含量，如通过抗原生产工艺改进来提升抗原的效价、通过抗原的浓缩提升抗原的病毒含量等。本试验结果表明，禽流感早期抗体的产生与抗原的病毒含量呈正相关，在免疫后期抗体趋于一致。

3）目前，禽流感感染禽很大一部分在早期，如一个月内的小鸡，甚至是10日龄左右的雏鸡。而用现有灭活疫苗免疫后，产生抗体较缓慢，不能产生可保护的抗体水平，所以，在小日龄鸡上免疫效果不佳。从本试验结果可以看出，通过浓缩提升抗原病毒含量，免疫后14～21 d的抗体有相应的提升，有更好的免疫效果，但是从生产成本上核算，成本增加了不少，很多厂家难以接受。目前也有很多厂家在寻找更好的方法，如在疫苗中添加免疫增强剂来提升免疫效果，这也是一种很好的方法。赵占民等［12］、陆新浩等［13］在研究中提到，免疫增强剂是一类单独使用或与抗原同时使用、通过非特异性途径增强机体免疫应答的物质，可增强机体的免疫功能，缓解由环境造成的免疫功能紊乱，有利于预防和治疗传染性和条件性疾病。

［1］赵雪丽，李明义，范根成.禽流感（H5、H9亚型）二价油乳剂灭活疫苗试验研究［J］.上海畜牧兽医通讯，2005（2）：22-24.

［2］甘孟侯.禽流感［M］.2版.北京：中国农业出版社，2002：1-14.

［3］童海兵，张小荣，吴艳涛，等.H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价［J］.中国家禽，2010，32（20）：243-244.

［4］韩建文.新城疫、禽流感（H5，H9亚型）油乳剂灭活疫苗中抗原含量与抗体关系的研究［D］.扬州：扬州大学，2007.

［5］赵君和.2016年禽流感的流行特点及防控策略［J］.中国畜牧兽医文摘，2016，32（1）：2-3.

［6］唐秀英，田国斌，于康震，等.禽流感油乳剂灭活疫苗的研究［J］.中国预防兽医学报，1999，21（6）：401-405.

［7］罗开健，辛朝安.禽流感油乳剂灭活疫苗的研制［J］.中国兽医杂志，2001，37（7）：6-9.

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［9］张健，王英珍，巴图，等.禽用油乳剂灭活疫苗生产工艺改进---病毒浓缩试验［J］.动物科学与动物医学，2002，19（8）：29-30.

［10］温志芬，陈瑞爱，唐满华，等.禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗不同剂量的免疫效果比较［J］.中国兽医科技，2003，33 （12）65-66.

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［12］赵占民，赵来兵，李全福，等.母源抗体对鸡新城疫疫苗免疫的影响［J］.中国兽医杂志，2004，40（3）：6-8.

［13］陆新浩，徐震宇，刘鸿，等.不同免疫增强剂对肉鸡禽流感免疫效果的影响试验［J］.浙江畜牧兽医，2010（6）7-9.

Detection of antibodies against bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and unequal contents of avian influenza virus in SPF chickens

Jiang Xinghua1Zhao Huae1Lin Xiaorong1Bao Songying1Cui Longping1Wang Quanxi2*
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

21-day-old specific pathogen free（SPF）chickens were inoculated with three kinds of bivalent newcastle disease and avian influenza（H9N2 HP strain）inactivated vaccines，which contained original newcastle disease virus（NDV）and primal，three folds of concentration，six folds of concentration of avian influenza virus（AIV），respectively.Every chicken in immune group was inoculated with a dose of 0.3 mL，and simultaneously，chickens were mock inoculated as control group.In order to detection antibodies of NDV and AIV blood samples were collected from both immune group and control group before immunization and at 0，7，14，21，28 and 35 day postimmunization（dpi），respectively.Results showed that，the antibody levels against NDV in each immune groups were basically consistent at different timepoints of post-immunization，the antibody levels against AIV increased depending on the virus quantity at 14 and 21 dpi，and then decreased gradually till to non-difference.Overall，antibody levels against AIV could represent the immune effect of this bivalent inactivated vaccines after immunization，and the improvement of antibody levels and immune effect in early immunization might be obtained by means of increasing the amount of antigens.

Newcastle disease Avian influenza Unequal contents of virus Bivalent inactivated vaccines SPF chickens Antibody levels detection

A

1003-4331（2016）04-0022-03

福州市区域重大项目（2015-Q-29）资助。

江兴华（1975-），男，高级兽医师，硕士生校外导师。主要从事兽用疫苗的生产与研发，jxhgreen@163.com。
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王全溪（1978-），男，副教授，博士研究生，硕士生导师。研究方向为宿主与病原互作，wqx608@126.com。