两种脾毒浓度对猪瘟活疫苗原料兔利用率的影响

林志坤　福州大北农生物技术有限公司　福州　350014

◆调查研究◆

两种脾毒浓度对猪瘟活疫苗原料兔利用率的影响

林志坤福州大北农生物技术有限公司福州350014

将原料兔随机分成两组（A、B），每组各4 772只。A组接种猪瘟活疫苗种毒，每毫升含0.05 g猪瘟兔化脾毒；B组接种的种毒，每毫升含0.02 g猪瘟兔化脾毒。每组分成30个批次，每个批次确定一个反应率。结果表明，A组30个批次的平均反应率（等同利用率）为90.49%，变动幅度为±7.0%；B组的平均反应率为67.71%，变动幅度为±16.24%，差异极显著。同时，A组的变异系数低于B组，表明A组利用率批间稳定性优于B组。

猪瘟活疫苗猪瘟活疫苗种毒

猪瘟活疫苗主要有猪瘟活疫苗（兔源）和猪瘟细胞苗，细胞苗包括牛睾丸细胞苗和ST传代细胞苗［1］。用于活疫苗生产的猪瘟种毒均需通过大兔进行传代复壮，以保证该毒株的免疫原性、有效性和安全性。但在传代过程中，由于受生产环境、家兔质量、生产工艺、内控指标等多种因素的影响，导致大兔利用率较低，批间差异较大。福州大北农生物技术有限公司通过调整接种种毒的病毒含量，提高了大兔的利用率和批间质量的均一性，实现了猪瘟种毒传代及猪瘟脾淋苗标准化生产。

1　材料与方法

1.1原料兔大兔9 544只，购自符合生产检验用动物标准规定的普通级动物标准定点合作兔场，经检验合格后，置于GMP生产动物房内饲养，喂以含16%粗纤维的全价料，提供充足净洁饮水，每个兔笼关1只兔。

1.2药品及试剂猪瘟兔化弱毒（冻干毒），购自中国兽药监察所，由福州大北农生物技术有限公司传代复壮；兽用生理盐水，由福州大北农生物技术有限公司配制。

1.3试验方法

1.3.1猪瘟兔化弱毒生产种毒的制备将冻干毒以3 mL生理盐水稀释，按1 mL/只耳静脉接种于健康原料兔进行复壮。通过测温观察选取定型热大兔，剖杀无菌提取脾脏即为第一代猪瘟兔化弱毒脾毒。将第一代猪瘟兔化弱毒脾毒用生理盐水进行50倍稀释，按1 mL/只耳静脉接种于健康大兔进行复壮。通过测温观察选取定型热大兔，剖杀无菌提取脾脏即为第二代猪瘟兔化弱毒脾毒。按照第二代猪瘟兔化弱毒脾毒生产的方法再复壮两代，即为生产种毒。

1.3.2种毒鉴定按照中华人民共和国 《兽用生物制品规程》2000年版《猪瘟活疫苗（兔源）生产工艺规程》对生产种毒进行鉴定，效价达到105RID/g的脾毒为合格的生产种毒，合格的生产种毒置于-15℃冰柜保存备用。

1.3.3常温监测对初步筛选的大兔常温监测2 d，每天测温2次，上午和下午各1次。选取常温合格的大兔随机分成两组，分别是A、B两组。每组160只大兔。测温时，兔仰卧放置于特制的固定架中，体温计水银球植入肛门内3 cm，每只兔测温1 min，每测完一只都将体温计放入凉水中洗净并将水银柱甩至刻度线之下。可同时使用多个兔固定架和多支体温计。

1.3.4制备种毒悬浮液选取合格的同一批次生产种毒，加生理盐水研磨制成两种不同浓度的种毒悬浮液，分别是A、B两种。A种毒每毫升含0.05 g猪瘟兔化脾毒；B种毒每毫升含0.02 g猪瘟兔化脾毒。

1.3.5种毒接种并测温用A、B两种种毒分别耳静脉接种大兔，其中A组接种A种毒，B组接种B种毒。接种24 h后上午和下午各测1次体温，24 h后每隔6 h测1次体温。按照判定标准统计各试验组定型热大兔的百分比即为各组大兔的利用率。

1.3.6重复试验重复上述试验30个批次，统计各试验组每批大兔的利用率，及各试验组30个批次总体的大兔利用率。

1.3.7定型热即合格大兔的判定攻毒后，潜伏期24～36 h，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温1℃以上，则判定该只兔产生定型热反应；其他情况为轻热、可疑、不发热时，兔脾淋组织不能用于生产疫苗。

2　结果

A、B两组各进行30个批次 ，各批次大兔利用率情况见图1。

将各批次的大兔反应率作为统计分析对象，以t检验进行统计分析。结果表明，A组反应率高于B组，且差异极显著，表明不同浓度种毒对大兔反应率的影响较大，该结果对提高大兔利用有指导意义。B组变异系数大于A组，表明B组批间大兔反应率的差异较大，可控性程度低；A组的变异系数小且反应率较高，表明A组每批间的大兔反应率相对较一致，可复制性程度高。见表1。

表1　各组的批次利用率与变异系数

以各组定型热的头数及无反应头数作为统计分析对象，以卡方检验进行统计分析。则A、B两组之间差异极显著，表明不同浓度种毒对大兔反应率的影响较大。见表2。

3　讨论

表2　A、B两种浓度种毒的大兔利用率

1）由于外界环境、人员操作及猪瘟弱毒特性等因素的影响，在种毒研磨及使用过程中会导致猪瘟弱毒部分损失［2］。因此，操作时要严格按照SOP进行，处处要细心，时时防污染。由于猪瘟弱毒的一些特性，当种毒浓度较低时，接种到大兔体内的有效猪瘟病毒粒减少，猪瘟病毒不能在兔体内繁殖，导致利用率偏低。有研究表明，兔在运输过程中可能接触猪瘟病毒，从而促使其体内产生抗猪瘟病毒的中和性抗体［3］。生产猪瘟活疫苗（兔源）时是将种毒经耳静脉注入兔体内，从理论上讲，血液中的抗猪瘟病毒中和性抗体能将注入血液中的猪瘟兔化弱毒中和掉一部分，从而影响兔接种后的定型热反应和疫苗效价［4］。因此，在生产疫苗时，本试验结果可为接毒量的确定提供参考依据。

2）由于猪瘟病毒不能产生细胞病变，国际上对病毒含量或者疫苗效价的检验主要依靠兔体定型热反应的方法［5］。由于不同个体对猪瘟兔化弱毒的敏感性不同，会造成一定的试验误差。试验结果也为猪瘟活疫苗 （兔源）检测用原料兔的筛选提供参考依据。异物进入机体，会引起免疫排斥反应，当种毒浓度偏低时，兔体将很快把猪瘟弱毒排出，使猪瘟病毒无法在兔体内繁殖，从而导致大兔利用率偏低。当种毒浓度高时，一部分猪瘟脾毒能避开免疫排斥反应，在大兔体内繁殖，从而提高大兔的利用率。

3）试验结果表明，单位浓度高的种毒，无论从大兔利用率还是批间稳定性来看均优于单位浓度低的种毒。使种毒的单位浓度达到相对较高的滴度，可克服大兔之间的个体差异，使每批大兔都有相对稳定且较高的利用率。

［1］冷和平，钟超武，曾俊霞，等.猪瘟细胞苗与脾淋苗的免疫效果对比试验［J］.养猪，2009（5）：73-74.

［2］刘志华.在制取猪瘟兔化弱毒"湿苗"中的几点体会［J］.中国兽医杂志，1987（7）：43-44.

［3］曾彦钦，吴润生，林志坤，等.酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响［J］.福建农业学报，2007，22（3）：283-287.

［4］曾彦钦，吴润生，林志坤，等.福建省肉兔体内猪瘟抗体水平的检测［J］.福建畜牧兽医，2007，29（1）：3-4.

［5］祖立闯，谢金文，沈志强，等.猪瘟疫苗质量的替代检验方法研究进展［J］.动物医学进展，2015（2）：76-79.

Effect of two kinds of lapinized spleen virus concentration on utilization rate of raw material rabbit for production of hog cholera live vaccine

Lin Zhikun
（Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014）

The raw rabbits were randomly divided into two groups（A，B），each group has 4 772 rabbits.The rabbits of group A were vaccinated with HCLV，contained 0.05 g per mil spleen tissue of rabbit；the rabbits of group B were vaccinated with HCLV，contained 0.02 g per mil spleen tissue of rabbit；Each group were subgrouped into 30 randomly，each subgroup could get one response rate.The results showed that the average response rate of 30 subgroups in group A was 90.49%，the changing range was±7.0%.The average response rate of 30 subgroups in group B was 67.71%，the changing range was±16.24%.The analysis showed a significant difference. The confficient of variation of group A is lower than that of group B，which showed that the stability of utilization rate in group A was better than that in group B.

Classical swine fever live vaccines Hog cholera live vaccine lapinized virus（HCLV）

A

1003-4331（2016）04-0001-02