实时荧光定量RT-PCR法比较猪瘟疫苗病毒含量

章秋月　马华魁　郑新平　陈鹏强　陈秋勇　胡崇伟　修金生　吴波平（.南平市星星畜牧有限公司　福建南平　353000；.福建农林大学动物科学学院　福州　35000；3.福建省动物疫病预防控制中心　福州　350003）

实时荧光定量RT-PCR法比较猪瘟疫苗病毒含量

章秋月1马华魁1郑新平1陈鹏强2陈秋勇2胡崇伟2修金生2吴波平3*
（1.南平市星星畜牧有限公司福建南平353000；2.福建农林大学动物科学学院福州350002；3.福建省动物疫病预防控制中心福州350003）

为有效检测福建省使用猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量，给养殖户选择高效疫苗提供科学指导。本研究收集福建省内使用的10个不同厂家生产的23个批次猪瘟疫苗，应用实时荧光定量RT-PCR方法检测疫苗中病毒核酸的含量，以其中的标准品对照，比较相应的兔体反应量。结果表明：抽检23个猪瘟疫苗样品合格率仅为69.56%，传代细胞苗的病毒含量相对较高，脾淋苗病毒含量优于细胞苗；不同厂家生产的同类型疫苗病毒含量差异大，同一厂家生产的同类疫苗存在批间差异。实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量是一种便捷、高效的方法，为今后临床猪瘟疫苗的使用提供有效指导依据。

猪瘟疫苗荧光定量RT-PCRTaqMan探针病毒含量

猪瘟（Classical swine fever，CSFV）是一种高度接触性传染病，遍布于全世界，OIE将其列为A类传染病，是目前危害我国养猪业的头号杀手，严重阻碍我国养猪业的健康发展［1］。猪瘟兔化弱毒疫苗，简称“C”株（Chinese strain），是目前世界公认的最好的猪瘟疫苗，在中国猪瘟防控中起着重要的作用［2-3］。但近年来，我国猪瘟疫苗免疫失败的病例逐渐增多，疫苗质量达不到要求是其中一个重要原因。我国对于猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗的大规模免疫为主，长期的临床使用和实验室检测都表明，猪瘟兔化弱毒疫苗能够为被免疫动物长时间提供广谱、持久、坚强的保护力，表现出极高的稳定性，理论上具有极佳的效力。但是为了能够在临床使用时发挥疫苗的最大作用，就必须实现对商品化疫苗质量的有效控制。疫苗质量控制的重要环节就是要保证所生产疫苗具有符合标准的效价，能够确实激活被免疫动物的免疫系统［4-7］。

由于猪瘟病毒不能产生细胞病变，国标中对病毒含量或疫苗效力检验主要依靠兔体定型热反应方法，该方法试验成本较高、操作繁琐、试验周期较长，且受试验动物个体差异、环境因素等多方面原因影响，检测结果不是十分准确［8-9］。因此，建立新型实用、标准化疫苗效力检验替代方法势在必行。荧光定量RT-PCR方法可以对病毒含量实时监测，具有特异、敏感、快速、高通量和实时等优点，为猪瘟病毒含量测定及猪瘟疫苗效力检验提供了新的技术支持［10］。本研究采用RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术，通过荧光信号的变化检测猪瘟病毒RNA，相对定量对比各批次间猪瘟疫苗的抗原含量。

1　材料与方法

1.1试验材料Hight Pure Viral RNA Kit购自Roche；PRRSV荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京生科尚仪；常规化学试剂、耗材和药品均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2待检疫苗收集省内使用的由10个厂家生产（A～J）的23种不同类型、不同批次疫苗，包括传代细胞苗、细胞苗、脾淋苗。

1.3病毒核酸提取将待检疫苗用灭菌生理盐水配制成20头份/mL原液，反复冻融3次后，3 000 r/ min离心2 min，取上清。按照动物组织基因组RNA提取试剂盒（Hight Pure Viral RNA Kit）操作方法提取疫苗RNA，洗脱核酸，后置于-20℃备用。

1.4实时荧光RT-PCR检测方法猪瘟疫苗病毒含量检测按照北京生科尚仪的方法进行：反应体系25 μL，其中 RT-PCR反应液 15 μL、Taq酶0.25 μL、模板 RNA 10 μL。反应条件为42℃、30 min，92℃、3 min后进入第一个循环，循环参数为92℃、10 s，45℃、30 s，72℃、60 s；5个循环后进入第二个循环，参数为92℃、10 s，60℃、30 s，40个循环；60℃时收集荧光。

2　结果与分析

2.1实时荧光定量RT-PCR检测结果检测1-23#猪瘟疫苗样品，结果见图1。

2.2疫苗抗原含量检测结果分析通过荧光定量RT-PCR对疫苗的抗原含量进行检测，以9号标准品为参照校准相应的RID值。结果表明：17-23#猪瘟活疫苗抗原量不合格，抽检样品合格率仅为69.56%；传代细胞苗的抗原量明显优于细胞苗和脾淋苗，检测还发现脾淋苗的抗原量优于细胞苗；不同厂家生产的同一类型疫苗，疫苗抗原量差异大，同一厂家生产的同种疫苗批间差异较大；以9号样品为参照标准，换算出各批次的大致兔体反应量，检测仍发现有部分厂家生产的猪瘟活疫苗抗原量为0以及不符合国标的疫苗（见表1）。

3　讨　论

1）目前，我国猪群流行的CSFV基因型仍以2.1亚型为主，2.1b类毒株为绝对优势流行毒株。根据中国兽医药品监察所王琴等［11-15］证实，猪瘟“C株”兔化弱毒疫苗对不同基因型CSFV毒株仍能提供有效保护，产生良好的体液和细胞免疫。李安等［12］建立基于SYBR Green iv实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量，进一步说明荧光定量RT-PCR代替兔体定型热反应的可行性。尽管客观上讲，荧光定量RT-PCR方法只能对CSFV疫苗中的核酸进行定量，但当选择恰当的标准品并在同一反应体系的前提下，核酸含量的多少还是能在较大程度上反映出病毒含量的高低。

2）当前养殖场的猪瘟免疫意识和生猪的猪瘟免疫密度都较高，80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗，种猪场几乎是100%免疫。但临床走访和检测发现，猪瘟免疫合格的养殖场比例并不高，仅在70%左右。猪瘟免疫失败的原因，一方面与临床使用的部分厂家猪瘟疫苗质量有关，另一方面与猪体的健康程度、免疫程序、母源抗体的影响及市场化疫苗的冷链系统等方面的问题有关。我国有优质的基础种毒，但因诸如细胞源疫苗、组织苗和传代细胞苗质量标准不同，生产工艺的多样化及不良市场竞争等，猪瘟疫苗的严格统一管理和质量控制存在一定困难，导致临床上猪瘟免疫效果不理想。

3）猪瘟病毒基因组稳定，变异频率低，只有一个血清型，且猪瘟疫苗依然是最优秀的疫苗［15-17］，这些都为猪瘟的控制提供了技术保障。规模化养殖场只要做好生物安全措施，坚决淘汰病原阳性猪，隔离圈建设与全面定期消毒，加大后备猪筛选和监测力度，严格人员出入，使用合格抗原量高的猪瘟疫苗，猪瘟是完全能够控制的。

表1　猪瘟疫苗抗原含量检测结果汇总表

［1］王海光.猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗效检替代方法和猪瘟病毒鉴别检测方法的建立［D］.北京：中国兽医药品监察所，2013.

［2］唐红慧.猪瘟兔化弱毒苗抗原量测定方法的探索及不同免疫程序的差异性比较研究［D］.扬州：扬州大学，2010.

［3］姚华伟.猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法及疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究［D］.重庆：西南大学，2011.

［4］李晶.猪瘟兔化弱毒疫苗国家标准品的初步研究与建立［D］.重庆：西南大学，2009.

［5］邓力.猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用［D］.杨凌：西北农林科技大学，2010.

［6］薛孝伦.猪瘟兔化弱毒乳兔组织湿苗含毒量测定［J］.四川农业科技，1981（1）：19-20.

［7］李春红，唐满华，陈瑞爱.猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法研究进展［J］.当代畜牧，2014（12）：34-39.

［8］祖立闯，谢金文，沈志强，等.猪瘟疫苗质量的替代检验方法研究进展［J］.动物医学进展，2015（2）：76-79.

［9］陈锴，姚华伟，王长江，等.荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用 ［J］.中国农业科学，2013（1）：162-169.

［10］范学政，宁宜宝，王琴，等.用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒 ［J］.中国兽医杂志，2010 （1）：8-10.

［11］王琴.我国猪瘟的分子流行病学监测及防控［J］.猪业科学，2010（1）：82-84.

［12］李安，崔言顺，沈志强，等.SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量 ［J］.中国兽医学报，2010（8）：1018-1022.

［13］李丽，陈弟诗，张毅，等.猪瘟病毒及猪瘟疫苗的研究进展［J］.当代畜牧，2014（8）：48-49.

［14］王琴，赵耘，范学政，等.国内部分猪瘟病毒流行株抗原性分析［J］.中国预防兽医学报，2012（6）：436-439.

［15］王琴.猪瘟流行现状及中国猪瘟净化策略［J］.中国猪业，2012（10）：45-47.

［16］刘俊，王琴，范学政，等.猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR鉴别方法的建立与应用［J］.中国农业科学，2009（12）：4366-4371.

［17］王毅，王琴，鲁小璐，等.猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）减毒的分子机制研究［C］.中国畜牧兽医学会生物制品学分会，中国微生物学会兽医微生物学专业委员会.首届中国兽药大会--兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集，2008.

Comparison of virus content in swine fever vaccine by fluorogenetic quantitative RT-PCR

Zhang Qiuyue1Ma Huakui1Zheng Xinping1Chen Pengqiang2Chen Qiuyong2Hu Chongwei2Xiu Jinsheng2Wu Boping3*
（1.Nanping Xingxing Animal Husbandry Co.，Ltd.，Nanping，Fujian 353000；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Fujian Province，Fuzhou 350003）

To effectively detect the quantity of the viral in swine vaccine in Fujian province，select high effective vaccine for the farms，23 batches vaccine from 10 different companies collected and used real-time PCR to detect the quantity of the viral.Using standard substance as control，we compared the corresponding RID.The result showed that the percent of pass in 23 batches vaccine is only 69.5%.The quantity of viral in passaged cell vaccine is relative high and the quantity of the viral in spleen vaccine is better than others.There is a big differences between different companies and between different batches in one company.Real-time PCR is an convenient and effective method to detect the quantity of the viral in swine vaccine and can provide useful guideline for selecting vaccine.

Swine vaccine qRT-PCR TaqMan Viral load

A

1003-4331（2016）04-0003-03

福建省农业科学技术项目（2014-01）、福建省自然科学基金项目（2013J05042）资助。

章秋月（1988-），女，硕士生。
*

吴波平（1980-），男，兽医师，从事动物疫病流行病学调查。E-mail：boping_wu@163.com。